Regeneracion De Columnas Presentacion 664l5

USO,MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

COLUMNAS PARA HPLC

COLUMNAS PARA HPLC

ENDCAPPING  El término "endcapping" fue introducido a finales de los

años 70, cuando se hizo evidente que algunos silanoles son todavía accesibles después de modificación superficial con ligandos de cadena larga.  Trimetilclorosilano es el reactivo más común para cubrir accesibles silanoles residuales.  Esta molécula es relativamente pequeña y puede penetrar a la superficie de la sílice y para abarcar "tope" algunas áreas irregulares de silanoles sin reaccionar.  Por lo general, conduce a la mejora significativa de las propiedades adsorbentes de fase reversa (menos asimetría y retención más predecible de compuestos polares).

 ESPECIFICACIONES COLUMNA C18.docx

USO Uso: •

Almacenar la columna en un solvente recomendado por el fabricante.

•

Colocar tapones durante no-uso.

•

Siempre “lavar” columna con un solvente fuerte.

•

Utilizar guarda columna o filtro en línea para alargar la vida de la columna

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PRECAUCIONES Precauciones: •

No exceder rango de pH de la columna.

•

No exceder rango de temperatura de la columna.

•

Nunca guardar la columna con sales o buffer dentro de ella.

•

Permitir que la columna se enfrie antes de detener el flujo.

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MANTENIMIENTO Y REGENERACION Mantenimiento y Regeneración:

•

Tiempo de vida desde 3 hasta 24 meses o de 1000 a 3000 inyecciones.

•

El desempeño disminuye con el uso (incremento en la presión y coleo de picos).

•

Monitorear presión (¡¡bitacoras!!), probar invertir columna.

•

Regenerar la columna con una serie de solventes de débil a fuerte y viceversa en forma gradual. 20

REGENERACION Regeneración de una columna  Adsorción irreversible de las impurezas derivadas de la matriz en la cabeza de la columna puede causar cambios en la selectividad o división de picos.  A menudo esas "columnas sucias" puede ser regeneradas mediante la aplicación de los siguientes protocolos.

FASE REVERSA La regeneración de empaque RP RP-empaques son fases estacionarias C18, C8, C4, C1, C30, fenilo. Lavar la columna con:  Agua 20 volúmenes de columna  Acetonitrilo 20 volúmenes de columna  Isopropanol 5 volúmenes de columna  Heptano 20 volúmenes de columna  Isopropanol 5 volúmenes de columna  Acetonitrilo 20 volúmenes de columna

Volumen de la columna  Para estimar el volumen de

    

columna se puede utilizar la siguiente ecuación: V = π*r2*L Donde: V : Volumen de columna en mL r : Radio de la columna en cm L : Longitud de la columna en cm

 Otro protocolo

FASE NORMAL La regeneración de empaque NP (fase normal) NP-empaques son sílice, Diol, nitro y amino fases estacionarias. Lavar la columna con:  Heptano 20 volúmenes de columna  Isopropanol 5 volúmenes de columna  Acetonitrilo 20 volúmenes de columna  Agua 20 volúmenes de columna  Acetonitrilo 20 volúmenes de columna  Isopropanol 5 volúmenes de columna  Heptano 20 volúmenes de columna

 Otro protocolo

INTERCAMBIO IONICO La regeneración de empaque de intercambio de iones Los empaque de intercambio iónico son de aniones o cationes (WCX, SCX, WAX y SAX). Lavar la columna con : • 20 volúmenes de columna del mismo eluyente, pero el doble

concentración de buffer. • Siga el protocolo de regeneración de empaque RP

• Agua 20 volúmenes de columna. • Equilibrar la columna ahora a las condiciones originales.

 Otro protocolo

COLUMNAS BASE DE POLIMEROS  Polímero. Poliestireno divinil benceno entrecruzado, polieteres y metacrilatos son los más comunes.  Tienen como desventaja que regularmente poseen menos eficiencia comparadas con las columnas de Si.  Fases estacionarias a base de polímeros muestran una mayor estabilidad del pH, operación en el intervalo de pH de 1 a 14. pero menor estabilidad mecánica, en comparación con las columnas a base de sílice.  También, empaques a base de polímeros no son compatibles con todos los disolventes orgánicos. Se hinchan o se contraen en algunos disolventes orgánicos.  Desafortunadamente, la estabilidad de la presión y la compatibilidad del disolvente son diferentes para la diferente naturaleza de los polímeros y de fabricante a fabricante. Por lo tanto, no hay reglas generales para el cuidado de la columna de materiales basados ​en polímeros no se pueden dar.  Lea siempre las instrucciones para el uso de esas columnas. En caso de duda, póngase en o con el fabricante correspondiente.

COLUMNA LA COLUMNA: Es responsable de la separación de los componentes. Requerimiento generales para una columna: • Funcionamiento reproducible de columna a columna • Suficiente numero de platos teóricos para el análisis. • Empaque de partícula de tamaño uniforme. • Fácilmente obtenible. • Larga duración (resistente) • Bajo costo.

COLUMNA Frit  El componente poroso en cualquiera de los extremos de una columna que sirve para contener el empaque de columna. Es colocado a los extremos de los tubos de la columna, o más comúnmente, en el final del fitting. Los Frits son hechos de acero inoxidable u otro metal inerte o plástico, como PTFE poroso o polipropileno.  Fittirng final y Frits (aparte del empque de la columna, estas partes de la columna son mas susceptibles de dañarse por uso inapropiado). El empaque de la columna se sostiene dentro de la columna por los trits, y los frits se sostienen dentro de la columna por el Fitting final.

COLUMNA

CARACTERISTICAS COLUMNAS LONGITUD .  Las columnas vienen a tamaños diferentes, con el diámetro interno (i.d). de la mayor parte de columnas igualan a 4.6 milímetros (el mm) = 0.46 centímetros La longitud de la columna es por lo general 10 o 15 cm de largo,

RELLENOS DE COLUMNA

Causas de falla en una Columna Para que la columna LC funcione bien , debe guardarse en la forma adecuada. Hay varias formas que la columna puede ser dañada, y esto se evidencia en el cromatógrama. • Picos de la muestra serán más amplios y no simétricos, • los tiempos de retención de diferentes picos pueden cambiarse, • La separación generalmente será más pobre

Causas de falla en una Columna Las causas mas importantes por las cuales una columna falla son: • Ataque químico Taponamiento de la columna con partículas • Choques mecánicos • Adsorciòn de impurezas

Ataque químico Las causas mas importantes por las cuales una columna falla son:

• 

Ataque químico

Ciertas fases móviles pueden quitar la fase enlazada de la superficie de la partícula de silicona, rompiendo el enlace químico que sostiene esta capa orgánica a la silicona.  Además estas mismas fases móviles a menudo pueden disolver a la misma silicona. Las mas agresivas son las fases móviles que son básicas (el pH mayores que 7) o fuertemente ácidas (el pH menos de 2.5).  Entonces la mayor parte de cromatografistas evita estos extremos de pH al desarrollar las condiciones para un procedimiento LC.  Si usted realmente trabaja en el pH más alto, es posible usar los empaques de columna que sobre todo son diseñados para soportar pH extremos.

TAPONAMIENTO DE LA COLUMNA • Taponamiento de la columna con partículas  La segunda causa de falla de columna es el taponamiento del frit o el empaque de la columna por las pequeñas partículas de residuos . Estas partículas a menudo son introducidas con la muestra, lo cual quiere decir que cualquier muestra que contiene partículas debería ser filtrada, usando un filtro de 0.5 micras que esta diseñado para muestras de HPLC. Si usted está en la duda sobre la presencia de partículas en la muestra, solamente sostenga la solución de la muestra (que usted va a inyectar) contra la luz, y agite con cuidado. Usted debería ser capaz de ver partículas flotantes o un aspecto nublado - si hay cualquier problema.

TAPONAMIENTO DE LA COLUMNA •

Taponamiento de la columna con partículas



El taponamiento de columna también puede ser causado por partículas en la fase móvil o arrastradas del sistema normal HPLC. Los sellos de bomba y las partes móviles del inyector de la muestra gradualmente se arrastran, deshaciéndose las partículas que pasan a la entrada de la columna. Las fases móviles que están constituidas de solventes HPLC, con nada más añadido, por lo general no tienen problema de partículas, si la cristalería usada es limpia y los depósitos son cubiertos para no dejar pasar el polvo. Estos solventes son filtrados con cuidado por el fabricante. Sin embargo si los elementos sólidos como buffers o reactivo de par iónico son añadidos a la fase móvil, es buena práctica filtrar las fases móviles finales antes del empleo. Partículas llevadas de sistema - que puede ser un problema importante – se maneja mejor usando un filtro en linea entre el inyector y la entrada de columna.

Choques mecánicos • La tercera causa de daño de columna es el choque mecánico. Recuerde que la columna es un artículo caro, varios cientos de dólares, entonces trátelo con el respeto que esto merece. No deje caer la columna, y cuando no es instalado sobre el sistema LC lo ponen con cuidado en su caja original para la protección. • Hay otros modos de dañar una columna, además de la golpeadura de ella. La fase móvil que se mueve por la columna ejerce una fuerza sobre el empaque de la columna, y si esta fuerza es bastante grande, esto causará que las partículas de columna se compriman juntas más fuerte - o aún romper las partículas .Esto entonces conduce a la formación de espacios vacíos en el empaque a la entrada de la columna. Un vacío va a en casi todos los casos causando una pérdida catastrófica en el funcionamiento de columna, y requieren su reemplazo.

Adsorción de impurezas Adsorción de impurezas

La causa final de daño de columna es la adsorción de impurezas de muestras "sucias". Las muestras que son sacadas de las plantas o especimenes de animales, muestras ambientales, o mezclas de reacción química, a menudo contienen los compuestos que son fuertemente atraídos a la fase enlazada. Estos gradualmente se acumulan sobre la columna y bloquean la superficie de la fase enlazada.  Los picos de la muestra entonces muestran la disminución en el tiempo de retención y el aumento de ancho, y tarde o temprano la columna debe ser desechada.  Esta acumulación " de la basura química " sobre la columna puede ser evitada por una limpieza inicial de la muestra antes de la inyección.  Las columnas que han acumulado estas impurezas, en algunos casos, pueden ser regeneradas, lavando la columna con solventes convenientes 

 Idealmente, toda la superficie del gel de ODS se modifica con

grupo funcional C18, sin embargo, habrá espacios restantes que no están modificados. Aquel parte se denomina  "silanol residual" y la presencia de silanoles residuales puede influir en la separación. A menudo para desactivar el residuo de silanol en los geles se aplica un tapado de extremos (endcapping).  Casi todas las columnas de ODS hoy en día son desactivadas <>, sin embargo, dependiendo del tipo de analito, la presencia de silanol pueden obtener mejores resultados de separación.