Guia Practica Quimica 2018 6fe2a

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA Y PATOLOGÍA

ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA GUÍA DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

DOCENTES JOSÉ FERNÁNDEZ RIVERA DANIEL VALDIVIA MAMANI RICARDO LEON VÁSQUEZ Nombre ……………………………………………………….. 1

AREQUIPA – PERÚ 2018

2

NORMAS DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO

1.

La asistencia es obligatoria a las clases prácticas.

2.

El ESTUDIANTE, SOLO, PODRÁ ASISTIR A LAS PRÁCTICAS LLEVANDO CONSIGO EL MANDIL CORRESPONDIENTE Y LOS UTILES NECESARIOS. El mandil es obligatorio y debe usarse durante todas las prácticas. En caso de contaminación debe esterilizarse antes de ser lavado.

3.

Para evitar contaminaciones fuera del local del laboratorio, lavarse las manos con agua y jabón al término de cada sesión de prácticas.

4.

No se permite comer ni beber ni fumar en el laboratorio.

5.

Evite llevarse objetos a la boca (lapicero, dedos, cuadernos, etc.)

6.

Si por accidente se derramara un cultivo de microorganismos u ocurre algún accidente inesperado, hágalo saber de inmediato al Profesor.

7.

Las mesas de trabajo deben mantenerse limpias y despejadas de prendas de vestir u otros objetos.

8.

Al concluir las prácticas deje siempre el Microscopio con los objetivos limpios de aceite de inmersión y con el objetivo de menor aumento.

9.

Tanto el ambiente como la mesa al finalizar el trabajo debe dejarse limpio como lo encontró.

10. Los trabajos experimentales durante las sesiones que han de realizarse, serán rotativos, para que todos los estudiantes tengan la oportunidad de participar activamente. 11.

No se olvide que el laboratorio de Microbiología es el lugar donde Ud. está trabajando con seres vivos y patógenos, por lo tanto debe tener sumo cuidado para no contaminarse.

12. Queda terminantemente prohibido sacar de las clases prácticas el material suministrado por la Cátedra. 13. Cada mesa dispondrá para el desarrollo de las prácticas de un encendedor, campo, lápiz para marcar vidrio, jaboncillo y toalla de manos. 14. Las actitudes de los cuales no está escrito aquí, el alumno optará según el sentido común, la razón, los buenos modales y la autoestima, obviamente de nivel universitario.

3

4

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA VICERECTORADO ACADÉMICO FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y FORMALES ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA SÍLABO 2018 - A ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

I. INFORMACIÓN ACADÉMICA: Periodo académico: Escuela profesional: Código de la asignatura: Nombre de la asignatura: Semestre: Duración: Número de horas Número de Créditos: Prerrequisitos:

2018-A Química 105132 Microbiología Industrial VII (Sétimo) Semestral 17 semanas Teóricas: 3 Practicas: 2 Seminarios 4 (cuatro) créditos) Biología

2. INFORMACIÓN ISTRATIVA PROFESOR: José Fernández Rivera GRADO ACADEMICO: Magister DEPARTAMENTO ACADÉMICO: Microbiología y Patología Lunes Martes Miercoles HORARIO 16.00-17.00 (T) 14.00-16.00 (T) Total 17.00-18.00 (S) 16.00-18.00 (P) Semanal AULA 206- 231

Teoria y Práctica

Aula: Lab 206 F.Medicina

Jueves

Viernes

Jueves

Viernes

Jueves

Viernes

Aula: Lab. 206-231 F.Medicina

PROFESORA: Blanca Mayorca Palomino GRADO ACADEMICO: Doctora DEPARTAMENTO ACADÉMICO: Microbiología y Patología HORARIO Total Semanal AULA 206-231 Teoria

Lunes 16.00-17.00 (T) Aula: Lab 206 F.Medicina

Martes

Miercoles 14.00-16.00 (T) Aula: Lab. 231 F.Medicina

PROFESOR: Daniel Valdivia Mamani GRADO ACADEMICO: Magister DEPARTAMENTO ACADÉMICO: Microbiología y Patología HORARIO Lunes Martes Miercoles Total 16.00-17.00 (T) 14.00-16.00 (T) Semanal 17.00-18.00 (S) 16.00-18.00 (P)

5

AULA 206-231

Aula: Lab 206

Aula: Lab. 206-231

F.Medicina F.Medicina Teoria y Práctica PROFESOR: Jorge Ballón Echegaray GRADO ACADEMICO: Magister DEPARTAMENTO ACADÉMICO: Microbiología y Patología HORARIO Total Semanal AULA 206-231 Teoria

Lunes 16.00-17.00 (T)

Martes


Miercoles 14.00-16.00 (T

Jueves

Viernes

Jueves

Viernes

Jueves

Viernes


PROFESORA: Irmia Paz Torres GRADO ACADEMICO: Doctora DEPARTAMENTO ACADÉMICO: Microbiología y Patología HORARIO Total Semanal AULA 206-231 Teoría

Lunes 16.00-17.00 (T)

Martes


Miercoles 14.00-16.00 (T Aula: Lab. 231 F.Medicina

PROFESOR: Ricardo león Vásquez GRADO ACADEMICO: Magister DEPARTAMENTO ACADÉMICO: Microbiología y Patología HORARIO Total Semanal AULA 206-231 Teoría

Lunes 16.00-17.00 (T) 17.00-18.00 (S) Aula: Lab 206 F.Medicina

Martes

Miercoles 14.00-16.00 (T) 16.00-18.00 (P) Aula: Lab. 206-231 F.Medicina

*Los docentes dictan las clases teóricas así como las clases prácticas, de acuerdo a la calendarización y el cronograma temático. SUMILLA DEL CURSO Conceptos: Desarrollo histórico y futuro de la Microbiología Industrial. Material Biológico. Microorganismos de interés industrial. Nutrición de los microorganismos. Producción industrial de metabolitos primarios. Recombinación genética. Tecnología del ADN recombinante. “in vitro”. Tecnología de las fermentaciones. Esterilización industrial. Preparación y propagación de inóculos.. Procesos fermentativos. Recuperación de los productos finales. Microbiología industrial en Biomedicina. Microbiología industrial en Alimentación. Producción industrial de aminoácidos. Microbiología industrial en Agricultura. CAPITULO I: Concepto, desarrollo histórico y futuro de la Microbiología industrial. CAPITULO II: Material Biológico.- Microorganismos de interés industrial. Aislamiento y selección de microorganismos de interés industrial. Conservación y mantenimiento de los microorganismos industriales. Nutrición de los microorganismos. Mecanismos reguladores y fermentaciones industriales. Producción industrial de metabolitos primarios Producción industrial de metabolitos secundarios. CAPITULO III desarrollo de Cepas Mutación.- Recombinación genética. Tecnología del ADN recombinante “in vitro”. CAPITULO IV Tecnologías de las fermentaciones.- Esterilización Industrial.

6

Preparación y propagación de inóculos. Procesos fermentativos. Recuperación de los productos finales. CAPITULO V : Microbiología Industrial en Biomedicina: Producción de antibióticos. Producción de vacunas. Producción de hormonas estereoideas. Producción de vitaminas. Producción de proteínas humanas recombinantes. CAPITULO VI Microbioogía Industrial en Alimentación:- Producción industrial de bebidas alcohólicas. Producción industrial de productos lácteos. Producción industrial de ácidos orgánicos. Producción industrial de aminoácidos. Producción industrial de enzimas. CAPITULO VII Microbiología Industrial en Agricultura.- Biofertilizantes. Combustibles.

COMPETENCIA GENERAL Posee conocimientos teóricos y prácticos de microbiología en cuanto a los caracteres de los microorganismos. Correlaciona la microbiología con las plantas, animales y seres humanos. Analiza e interpreta los cambios positivos y negativos que ocurren en el planeta por la acción metabólica de los microorganismos. Práctica una actitud positiva valorando los microorganismos al observar, cultivar y experimentar personalmente de lo que son capaces Comprueba la participación de las bacterias, hongos en la industria alimentaria y farmacéutica Investiga y plantea propuestas de protección, desarrollo y conservación del medio ambiente y del planeta Valora la importancia de los microorganismos en la biotecnología en beneficio del hombre.

V. COMPETENCIAS DE LA ASIGNATURA TEMAS TEMA 1:Conceptos TEMA 2: Material Biológico TEMA 3: Desarrollo de Cepas Mutación TEMA 4: tecnología de las fermentaciones

TEMA 5: Microbiología industrial en Biomedicina TEMA 6: Microbiología Industrial en Alimentación TEMA 7: Microbiología Industrial en Agricultura

COMPETENCIAS Explica la importancia de los microorganismos para el ser humano Diferencia células procarioticas de las eucariotes y describe la morfología y estructura bacteriana. Explica la reproducción de microorganismos Diferencia la recombinación genética de transducción, transformación, Conjugación Explica los tipos de fermentación e importancia. Prepara los inóculos y explica los tipos de fermentación. Valora le importancia de los hongos filamentosos y levadura en beneficio del hombre. Explica como se producen las vitaminas y antibióticos Explica en que consiste la producción de proteínas humanas recombinantes Explica la producción de productos lácteos, y principales géneros participantes en la elaboración de yogurt. Explica la producción de ácidos orgánicos Valora la importancia de los microorganismos en la fertilización de suelos y la participación de

7

microorganismos en el control biológico

VI. CONTENIDOS DE LA ASIGNATURA CM. Clase magistral P: Clase practica

S: seminario

PS y EU: Poyección social y extensión universitaria

A través del contenido temático, los profesores revisarán y actualizarán los aspectos básicos de cada tema propuesto y los darán a conocer a los alumnos mediante clases magistrales Prácticas de laboratorio: Constituye una estrategia formativa donde las unidades de aprendizaje requieren de material e instrumental especializado. Se llevarán a cabo mediante la ejecución de el método microbiológico, y les permitirá afirmar los conocimientos adquiridos en la teoría. La actividad predominante es la experimentación. Se realizarán exámenes microbiológicos de agua, alimentos para aislar e identificar microorganismos perjudiciales para la salud de las personas y el medio ambiente. La asistencia a prácticas es obligatoria. 30% de inasistencia el alumno esta en ABANDONO. Donde la actividad dominante es la investigación formativa, los alumnos reunidos en grupos y como asesor un docente, realizarán un trabajo de investigación en forma experimental, el mismo que deberá ser presentado y expuesto al resto de sus compañeros. La asistencia a los seminarios es obligatoria los estudiantes darán charlas educativas en colegios como evitar la contaminación de alimentos por parte del manipulador de alimentos (kioskos de comida).

PRIMERA FASE FECHA DE INICIO 19-03-2018 FINALIZACIÓN 20-04-2018 CAPÍTULO 1: CONCEPTOS BASICOS FECHA 19-03-18 21-03-18 21-03-18 26-03-18

28-03-18

02-04-18

04-04-18

TEMA Inaugural.

Clase Lineamientos del curso 1.2. Importancia del curso en la formación profesional el Químico Mundo Microbiano. Célula procariote y eucariote. Bacterias. Tamaño, Forma y agrupación 1.3.Desarrollo de la microbiología. Microbiología precientífica. Microbiología científica. Etapas del desarrollo de la microbiologìa. 1.4.Caracteres de los microorganismos: Morfología. Tamaño. Tipo de agrupación. Reacción a la coloración de Gram. 1.5. Bacterias, Estructuras: Pared celular. Membrana celular. Citoplasma genoma Nucleoide, citoplasma;, , Cápsula. Glicocaliz. Apéndices: flagelos y fimbrias. Endosesporas. 1.7. Importancia de los microorganismos. 1.1.

ESTRATEGIA

DOCENTE

CM

J.Fernandez

CM

J.Fernández

CM

J. Fernandez

CM

B.Mayorca

CM

D.Valdivia

CM

D.Valdivia

%

8

Actividad de los microorganismos en los diferentes aspectos de la vida humana positivos y negativos

CAPITULO 2: MATERIAL BIOLÓGICO FECHA 04-04-18

11-04-18

11-04-18

16-04-18 18-04-18

25-04-18

TEMA 2.0. Microorganismos de interés industrial, aislamiento y selección de microorganismos. Conservación y mantenimiento de las cepas industriales. 2.1.Nutrición Bacteriana. Nutrientes – compuestos químicos .y condiciones físicas. Tipos nutricionales. Medios de cultivo. Metabolismo. Enzimas fermentación respiración. Biosíntesis. 2.2. Reproducción bacteriana. Genética. Genoma procariótico. ADN bacteriano. Replicación. Mutaciones. Mecanismos de intercambio genético. Investigación teórica: Los microorganismo en la microbiología industrial, importancia 2.3.Mecanismos reguladores y fermentaciones industriales. Producción industrial de metabolitos primarios. Producción industrial de metabolitos secundarios. PRIMER EXAMEN

CM

DOCENTE B.Mayorca

CM

B.Mayorca

CM

I.Paz

CM

D. Valdivia

CM

R.León

ESTRATEGIA

%

SEGUNDA FASE FECHA DE INICIO 19-04 -2018 FINALIZACIÓN 25-04-2018 CAPÍTULO 3: DESARROLLO DE CEPAS MUTACION FECHA 02-05-18

02-05-18

TEMA 3.0.Recombinación genética. Hechos moleculares importantes en la recombinación genética. Detección de la recombinación. Complementación. Transformación genética. Plasmados, naturaleza física de los plasmados. Tipos de plasmados . Plasmidos de resistencia 3.1.Microbiología del agua. Aguas atmosféricas, superficiales y profundas. Agua potable. Potabilización. Control microbiológico.

CM

DOCENTE J. Ballón

CM

D.Valdivia

ESTRATEGIA

%

9

07-05-18

3.2.Microbiología de agua residuales. Participación de los microorganismos en el tratamiento de aguas negras.

CM

D.Valdivia

CAPITULO 4 TECNOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES FECHA 09-05-18

14-05-18 16-05-18

16-05-18

21-05-18

23-05-18

23-05-18

28-05-18 30-05-18

6-6-18

TEMA 4.0 Esterilización industrial: Control del crecimiento bacteriano. Esterilización por calor seco, calor húmedo, esterilización por radiación. Esterilización por radiación. Control químico del crecimiento. Desinfectantes y antisépticos. 4.1 Preparación y propagación de inóculos. Preservación del inóculo. Multiplicación el inóculo. Cultivos 4.2.Procesos fermentativos. Clasificación de las fermentaciones, Quimiostato, Tipos de fermentadores. 4.3.Enterobacterias: E. coli, bacterias coliformes 4.4.Cocos Gram positivos: Streptococcus, Staphylococcus, Neumococo 4.5.Bacilos Gram positivos formadores de esporas aerobios Bacillus subtilis, , Bacillus thurigiensis. Bacillus antrhacis. 4.6.Recuperación de los productos finales. Separación de las partículas. Desintegración de los microorganismos. Métodos de aislamiento. Rendimiento. Inmunidad innata y adquirida. 4.6.Hongos Filamentosos, estructura fisiología caracteres generales. Clasificación. Hongos, Filamentosos. Investigacion teorica: Importancia de los microorganismo en Quimica 4.7.Hongos levaduriformes. Importancia. Caracteres morfológicos y bioquímicos Participación de las levaduras en la panificación SEGUNDO EXAMEN

CM

DOCENTE J.Fernández

CM

B.Mayorca

CM

J.Ballón

CM

I.Paz

ESTRATEGIA

%

J.Ballón CM

J.Ballón

CM

I.Paz

J.Fernandez

CM

R.Leon

CM

J.Fernandez

TERCERA FASE FECHA DE INICIO 11-06-2018 FINALIZACIÓN 20- -2018 10

CAPÍTULO 5: MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL EN BIOMEDICINA FECHA 11-06-18 13-06-18 18-06-18 20-06-18

TEMA 5.0.Producción de antibióticos 5.1. Producción de vacunas. Producción de hormonas estereoideas 5.2.Producción de vitaminas 5.3. Producción de proteínas humanas recombinantes

ESTRATEGIA

CM CM

DOCENTE J. Fernández B.Mayorca

%

R.León R.León

CAPITULO 6: MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL EN ALIMENTACION FECHA 20-06-18 25-06-18

27-06-18

27-06-18 02-07-18

TEMA 6.0: Producción industrial de bebidas alcohólicas. 6.1 Producción industrial de producto lácteos. Microbiología de la leche y productos lácteos. Contaminación microbiana. Microorganismos patógenos transmitidos por la leche. Los m.o en la preparación de productos lácteos. Yogurt. Principales géneros participantes en la elaboración del yogurt 6.2. Microorganismos que intervienen en la elaboración de quezos. Principales géneros de microorganismos participantes en la elaboración de quezos 6.3. Producción industrial de ácidos orgánicos. Ac. Cítrico, Ac. Glutámico, Ac. Acético. 6.4.Producción industrial de aminoácidos. Producción industrial de enzimas

ESTRATEGIA

CM

DOCENTE J. Fernández

CM

J.Ballón

CM

R.León

CM

J.Fernández

CM

B. Mayorca

%

CAPITULO 7:MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL EN AGRICULTURA FECHA 04-07-18 04-07-18 11-07-18

TEMA 7.0. Producción industrial en agricultura: Los suelos como ambiente para los microorganismos. 7.1. Biofertilizantes. Importancia del género Bacillus en la producción de insecticidas TERCER EXAMEN

ESTRATEGIA

CM

DOCENTE D.Valdivia

CM

R.León

%

PRACTICAS DE LABORATORIO: 11

Nº PRACTICA

AVANCE %

FECHA

21-03-2018 1

7.14

28-03-2018

2

14.28

04-04-2018

3

21.42

11-04-2018

4

28.56

18-04-2018

5

35.7

02-05-2018 07-05-2018 09-05-2018

TEMA

Distribución de grupos. Equipo y material de vidrio utilizado en el laboratorio de microbiología Microscopia: Examen al Fresco. Coloración de Gram. Coloración de azul de metileno. Observación de la morfología de las bacterias Microscopia: Examen al Fresco. Coloración de estructuras bacterianas: Wirtz Cocklin. Coloración de Ziehl Neelsen. Preparación medios de cultivo Esterilización. Procedimientos Físicos. Químicos y Radiación Método bacteriológico I laboratorio de Enterobacterias. Cultivo primario Proceso bacteriologico II estudio de los caracteres culturales. siembra en medios Bioquimicos Método bacteriologico III: lectura simbolizacion e interpretacion de las pruebas bioquímicas. Mutación Genética por Radiación. Laboratorio de cocos Gram positivos Microbiología del agua : Prueba presuntiva, confirmativa

6

42.84

7

49.98

8

57.12

30-05-2018 anaerobios esporulados

9

64.26

10

71.4

Lectura Obtención de ADN. 07-06-2018 Lectura e imterpretación 11-06-2018 Método micológico I: Muestras, microscopía, cultivo siembra

11

78.54

13-06-2018

12

85.68

20-06-2018 Reacción antígeno . anticuerpo.

13

92.82

14

100.0

Producción de antibióticos Microbiología de productos lácteos: producción de yogurt y 27-07-2018 quezo. Producción de inoculantes: microbiología del suelo 04-07-2018 Producción de inoculantes: microbiología del suelo

23-05-2018

Microscopia de Bacilos Gram Positivos Bacillus aerobios y

Método micológico II Identificación de Mohos y levaduras. Preparación de bebidas alcoholicas.

VII. SEMINARIOS (INVESTIGACION FORMATIVA): 12

DEL…19 de marzo……….AL 20 de julio .TOTAL HORAS 17hrs por seminario COMPETENCIA HORAS CONTENIDOS SIGNIFICATIVOS (CONCEPTUAL, PROCEDIMENTAL, ACTITUDINAL) Elaboración del proyecto de investigación. Observa y experimenta las diferentes tomas de muestra para su análisis.

1.

Producción de antibióticos 2.- Analisis microbiológico de aguas 3.- Calidad bacteriológico de helados que se expenden en la ciudad de Arequipa 4.- Producción de bebidas alcoholicas 5.- Producción de Biofertilizantes 6.- Lixiviacion bacteriana

Se esfuerza por conocer un método de análisis

VIII. CALENDARIZACIÓN E INCIDENCIA DE LOS INSTRUMENTOS DE EVALUACIÓN COMPONENTE TEORIA

PRACTICAS

SEMINARIO

PROYECCION SOCIAL Y EXTENCION UNIVERSITARIA TOTAL

INSTRUMENTO PRIMER EXAMEN SEGUNDO EXAMEN TERCER EXAMEN PRIMER EXAMEN SEGUNDO EXAMEN TERCER EXAMEN Asistencia (lista) TRABAJO EN GRUPO EXPOSICION INFORME (Documento escrito)

% DE INCIDENCIA 16 17 18 10 10 10 5 5 5

FECHA 25-04-18 06-06-18 11-07-18 25-04-18 06-06-18 11-07-18 11-07-18 11-07-18 11-07-18

4

11-07-18

100

IX. BIBLIOGRAFIA BIBIOGRAFÍA BASICA PELCZAR, M. 1995. 4ta Edición Edit. Panamericana BROOK 2009 Biología de los Microorganismos Ed. Prentice Hall 12va edición. Madrid España. PRESCOT . 2009 Microbiología 8ava edición Mc Graw-Hill-Interamericana de España KONEMAN, E.W. 2008 Diagnóstico Microbiológico. Edit. Médico Panamericana S.A. ZINSSER, H. 1997 Microbiología, Editorial Panamericana, Bs. As. Argentina BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA SALLE, A.J. 1986. Bacteriología 2da Edición, Barcelona , España JAY J.M. Microbiología Moderna de los Alimentos. Editores Acribia S.A. Zaragoza

13

España 2000. AHMED E. CAROLYN C. Microbiología de los alimentos. Manual de Laboratorio. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España 2006. ABBAS, LITCHMAN Inmunolugía celular y molecular.2014 MENDO, M. 1987. Medios de cultivo en Microbiología 3ra. Edición U.N.M.S.M. Lima, Perú

FECHA…Arequipa 12 de enero del 2018

________________________________ FIRMA DEL COORDINADOR DE LA ASIGNATURA Mg. José Alberto Fernández Rivera

_______________________

_______________________

Docente : Dra. Blanca Mayorca Palomino

Docente: Mg Daniel Valdivia Mamani

_______________________

_______________________

Docente :

Docente:

Mg. Jorge Ballón Echegaray

Dra. Irmia Paz Torres

_______________________ Docente :

Mg: Ricardo León Vásquez

VºBº DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO Mg. Jorge Ballón Echegaray PRÁCTICA N° 1 RECONOCIMIENTO DE MATERIAL

14

INTRODUCCION Algunos de los instrumentos más utilizados en los laboratorios, son elaborados de vidrio resistente a altas temperaturas, por su alto contenido de dióxido de silicio, bajo álcali, óxido bórico y vestigios de otros óxidos, lo que condiciona su escaso coeficiente de dilatación, teniendo una gran aplicación en la fabricación de materiales de laboratorio, uno de los mas conocidos es .el vidrio PYREX. Así como los elaborados de distintos metales pesados como platino,' mercurio, aluminio, cobre que les otorgan características como buenos conductores del calor o por que al medio ambiente son muy manejables sin alterar su composición OBJETIVO Que el alumno conozca parte del material necesario en un laboratorio de microbiología y parasitología. Que el alumno aprenda a manejar el material utilizado en un laboratorio de microbiología y parasitología MATERIAL DE VIDRIO Constituye una de las principales herramientas para los fines que se persigue en el aboratorio. Los requisitos necesarios para que un material sea un "buen material", son 1.Ser de buena calidad; es decir que no sean fácil de quebrarse. 2.Ser de color neutro. 3.Poseer resistencia a las acciones mecánicas y a las variaciones de temperatura así como también a los álcali-libre (no se raje). 4.Poseer bajo coeficiente de dilatación (que no pierda su forma). Tubos de Ensayo: Se emplean como recipientes de medios de cultivo. Tubos de prueba Deben ser de vidrio neutro, paredes gruesas y equilibradas, de preferencia sin rebordes para facilitar el taponamiento. De 16 x 150 mm De 15 x 125 mm De 13 x 100 mm para estudio de fermentación trabajos mecánicos De 10 x 75 mm pruebas, estudios serologicos.

Tubos de Roux Con escotadura de 4 cm. de fondo, de 25 x 200 mm para

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Tubos de centrífuga De vidrio, pueden ser cónicos o cilíndricos, siempre de De paredes gruesas, por estar inmersos rotando a alta velocidad.

paredes

gruesas,

De polietileno, se utiliza para centrifugaciones a altas velocidades, de medidas semejantes a los anteriores

Cápsulas o Placas Petri: Cajas cilíndricas, se emplean como recipientes de medios de cultivo para el cultivo y aislamiento de microorganismos. Las más usadas son las de 10, 15 ó 20 mm x 100 mm.

Espátulas de Meta con mango de madera Estuches cilíndricos o Cubículares Mecheros de Bunsen Canastillas o Cestos de Metal Soportes Universales Trípodes Asa de Kolle Varillas metálicas o de vidrio que llevan en un extremo alambre de platino; cuando el alambre es recto se llama Micrón y cuando el alambre forma un anillo de diámetro variable en su extremidad toma el nombre de asa.

Centrífugas:

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Se utiliza en la separación de sólidos suspendidos en líquidos. Hay centrífugas de tamaño y velocidades variables, la velocidad, se mide en revoluciones por minuto, La velocidad a la cual sedimentaran las partículas en un líquido dependen de varios factores: Tamaño de la partícula. El peso de la partícula. La viscosidad del líquido. La fuerza gravitacional Ultra centrifugación; para obtener alteraciones elevadas (mayor o igual a 100 000 g), pueden ser: Ultra centrifugación analítica: para determinación de características físicas de proteínas o de Acido nucleicos. Ultra centrifugación preparativa: permite la separación de organelos Baños de agua También llamados BAÑO MARIA tienen salida de aire presentan un termostato que regula la temperatura del agua presenta un piso para colocar los materiales que se desea Refrigeradoras y congeladoras Son incubadoras de temperatura fría menor de cero grados y los frigideres de dos a siete grados Filtración Sirve para separar materiales líquidos de sólidos un ejemplo los FITROS DE MEMBRANA Autoclave Funciona por las presiones que se dará a una mayor temperatura logrando su esterilización como por ejemplo las conservas

Horno Pasteur Es como una mufla que tiene tres paredes y la cubierta es de asbesto sirve para la esterilización por el calor seco. Estufas de aire caliente Al igual que el anterior es utilizado en la esterilización por el calor seco. Tienen solo dos paredes y son de forma cúbica.

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Mechero bunsen: Dispositivo que se utiliza mucho en los laboratorios debido a que proporciona una llama caliente, constante y sin humo. Debe su nombre a Robert Bunsen el que lo creo. Los mecheros Bunsen constan de un tubo vertical, enroscado en su parte baja a un pie por donde entra el gas.Mediante un aro metálico móvil se regula la entrada de aire. La mezcla se enciende por la parte superior. REALIZAR ESQUEMAS

PRACTICA Nº 1 MICROSCOPIA: EXAMEN AL FRESCO INTRODUCCION

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Con el microscopio podemos observar organismos y estructuras que son invisibles por simple inspección ocular. La morfología de las bacterias se puede examinar de dos maneras: 1. Observando los microorganismos vivos sin teñir. 2. Observando células muertas teñidas con colorantes. Para hacer un estudio de los microorganismos, se suele recurrir a técnicas especiales que van a permitir el acondicionamiento del material para dicho estudio. Los colorantes y coloraciones se usan en estudios macro y microscópicos, por ejemplo: para estudios de la actividad bioquímica de los microorganismos, clasificación de los microorganismos, etc. Para efectuar una observación del microorganismo, los métodos de coloración son diversos y además, constituyen un ítem más que posibilita realizar una clasificación, es decir, que hay técnicas que permiten hacer un diagnóstico informando cómo reacciona una célula microbiana a ciertas manipulaciones físicas y químicas con los colorantes (ejm: métodos de Gram-Nicole, ácido-alcohol resistencia, etc.). El descubrimiento del microscopio de contraste de fases y el uso del microscopio electrónico para exámenes de microorganismos, han dejado de lado muchas de las técnicas de coloración. A pesar de ello, los colorantes y las coloraciones se siguen usando en trabajo de diagnóstico y de investigación por ser de un manipuleo sencillo y de fácil comprensión e interpretación. EXAMEN AL FRESCO

Muestra 10 X

Muestra 40 X

MICROSCOPIA II COLORACIÓN DE GRAM Y AZUL DE METILENO Colorantes

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Los colorantes son compuestos químicos que tienen la capacidad de comunicar su color a otros cuerpos y quedar fijados a pesar de ser lavados con solventes ácidos o álcalis débiles. La coloración que así se obtiene, se debe a una absorción selectiva de la luz, lo que da como resultado, cuerpos coloreados con un color complementario del que ha sido absorbido. Muchos colorantes son moléculas cargadas positivamente o negativamente es decir son cationes o aniones, los que dan las reacciones correspondientes cuando se unen a otras moléculas con cargas complementarias. Muchas veces, los colorantes necesitan de la adición de otras sustancias con la finalidad de aumentar o de dar una afinidad química que ellos o el cuerpo a colorear no posee. Estas sustancias se denominan mordientes y también pueden ser aplicadas en forma independiente. La combinación mordiente más colorante forma lo que se denomina laca. colorante + mordiente = laca Métodos de Coloración La coloración tiene por objeto, fijar el colorante sobre el objeto a colorear de tal manera qué, después de sucesivos lavados con solventes, el objeto quede coloreado. Los métodos para el estudio de materiales biológicos, pueden ser agrupados en dos categorías: 1) los que estudian al organismo vivo en su estado natural se denominan Coloraciones vitales o in vivo y 2) los que lo estudian después de su muerte se denominan Coloraciones no vitales o post-vitales. 1) Coloraciones vitales o in vivo: En este tipo de coloraciones, se trabaja con el material sin que se produzcan modificaciones en sus estructuras biológicas. Esto permite el estudio del material «in situ», para ello se debe trabajar con colorantes diluídos y no tóxicos. Dentro de estas coloraciones, están las supravitales: en donde se sumerge el material o fragmento de células vivas dentro de la solución colorante a usar (ej: levaduras teñidas con azul de metileno para diferenciar vivas de muertas); y las intravitales que son aquellas en donde se inyecta por vía subcutánea, endovenosa o intramuscular, soluciones muy diluídas de colorantes, en el interior de animales de experimentación donde se encuentra el organismo en estudio; luego de 20 o 30 minutos, se sacrifica al animal y el tejido que nos interesa, se coloca entre cubre y portaobjetos con solución fisiológica y se observa al microscopio. 2) Coloraciones no vitales o post-vitales: En este tipo de coloración se encuentran: - Directa: cuando se produce una simple inmersión en el baño del colorante. - Indirecta: cuando se necesita con colorante de un mordiente. - Progresiva: se usan soluciones colorantes diluidas hasta obtener la intensidad de color deseada. OBJETIVOS - Observar su movilidad. - Entrenamiento en preparación de extendidos y realización de coloraciones. - Observación microscópica de morfología y agrupamientos bacterianos. MATERIALES - Suspensión de bacterias

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-

Láminas porta objetos y laminillas cubre objetos. Mechero a gas ( bunsen) Microscopio. Coloración de Gram. Coloración Azul de Metileno. Láminas preparadas de la cátedra.

COLORACION AZUL DE METILENO Se usa en la investigación de microorganismos que a pesar de ser transparentes pueden ser observados al estado fresco, al microscopio, sin hacer actuar sobre ellos ningún colorante, se pone también de manifiesto funciones biológicas como movilidad, luminosidad, refringencia, etc. OBJETIVO Comparar el tamaño de las bacterias con otros microorganismos. Observar la movilidad de microorganismos vivos. MATERIAL Muestras de aguas estancadas Tubos de centrifuga Laminas portaobjetos Centrífuga

Asa bacteriológica Mechero a gas Microscopio Cultivos de bacterias

PROCEDIMIENTO Colocar una gota de agua sobre una lámina portaobjeto, usando una asa bacteriológica y luego cubrirla con una laminilla cubreobjetos secos de 10 x y 40 x. Observar con lentes objetivos secos de 10 x y 40 x. COLORACION AZUL DE METILENO La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. La coloración azul de metileno se usa para observar morfología, agrupación, elementos celulares, leucocitos, células epiteliales. etc. (Ver Procedimiento en Métodos de Coloración)

COLORACION DE GRAM La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de

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Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tinción de GRAM Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram positivas y Gram negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula Gram positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%90% de la pared de la célula Gram positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram negativa es peptidoglicano. PROCEDIMIENTO 1. Preparar el frotis. 2. Fijar la preparación a la llama. 3. Hacer actuar el colorante de Violeta de Genciana (solución acuosa al 1%), y tres gotas de Bicarbonato de Sodio al 5%, dejar actuar por 1 minuto. 4. Lavar la preparación con agua de caño y cubrir la preparación con la solución de Lugol, dejando actuar este mordiente por tres minutos. 5. Lavar con agua de caño y decolorar la preparación con alcohol de 95% durante l0 a 15 segundos. Lavar con agua de caño. 6. Cubrir el frotis con el colorante Safranina (solución acuosa al 1%) durante 2 minutos, lavar 7. Secar y observar al microscopio usando objetivo de inmersión.

COLORACIÓN AZUL DE METILENO, COLORACION DE GRAM

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COLORACION AZUL DE METILENO

Muestra _____________100 X

Lamina stock ___________100 X

COLORACION DE GRAM

Muestra _____________100 X


PRACTICA N° 2

COLORACIONES ESPECIALES: ZIEHL NEELSEN Y COLORACIÓN DE WIRTZ COKLIN

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Se denominan gérmenes alcohol ácido-resistentes a un grupo de organismos que, una vez teñidos con solución colorante-mordientes, tienen la propiedad de resistir la decoloración por ácidos minerales (ácido sulfúrico o nítrico) y alcohol. Este carácter de ácido alcohol resistencia se debe a las sustancias serosas y lipídicas que contiene la membrana de envoltura de éstos gérmenes y que varía en las diferentes especies. Entre los gérmenes ácido-resistentes se encuentran especies saprofitas y patógenas. Saprofitas son: por ejemplo M. phlei, M. smegmatis, Representantes patógenos son el M. tuberculosis, M. leprae, M. kansaii. FUNDAMENTO DE LA COLORACION: La coloración de Ziehl neelsen se basa en que el fenol facilita la entrada del colorante y este interactúa con los ácidos micólicos para formar un complejo. Una vez formado el complejo los organismos que posean en su pared bacteriana los ácidos micólicos no decoloraran al ser lavados con el alcohol ácido, ya que estos ácidos no permiten que el alcohol ácido interactúe con el colorante y lo remueva, por lo tanto los organismos que no posean estos ácidos en su estructura decoloraran al ser lavados y no retendrán la coloración inicial y tomarán la coloración de contraste. Como colorante de contraste se utiliza el azul de metileno, que en algunos casos es reemplazado con ácido pícrico, los bacilos aparecen de un color granate oscuro en un fondo azul si se usa azul de metileno como en este caso o amarillo se usa el ácido pícrico. OBJETIVO Detección en materiales biológicos de especies de Mycobacterium y otras especies como Nocardia y Criptosporidium. PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIÓN DE BACTERIAS ALCOHOL- RESISTENTES: MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN:          

ACIDO

Hacer frotis del esputo con el asa bacteriológica en una lámina límpia y nueva. Secar al aire y fijar por calor. Cubrir todo el portaobjeto con Fucsina fenicada. Calentar suavemente con el mechero hasta la emisión de vapores. El colorante no debe secarse ni hervir, añadir más si es necesario. Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos. Lavar con chorro de agua suave. Decolorar con alcohol ácido al 3% (alcohol 70 ml. ácido clorhídrico 30 ml.). Lavar con agua de caño. Cubrir el frotis con azul de metileno al 1% y dejar actuar durante un minuto. Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

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INTRODUCCION La coloración de Wirtz Coklin es una coloración especial para teñir endosporas de bacterias. Existen dos géneros de bacterias que esporulan cuando encuentran las condiciones adecuadas para su desarrollo y son: Bacillus (aerobios) y Clostridium (anaerobios. Objetivos - Realizar en forma correcta la coloración de WIRTZ COKLIN y hacer la lectura correcta. - Explicar en forma breve y concisa, de que tipo son y para que se utiliza la coloración. Material - Placas petry con cultivo de Bacillus subtilis en agar triptosa. -Láminas portaobjetos limpias. - Solución acuosa de verde de malaquita. - Solución acuosa de safranina al 0.75% - Asa de Kolle -Mechero bunsen - Microscopio óptico Procedimiento Observar los caracteres culturales del cultivo de Bacillus subtilis . Prepara un frotis y realizar la coloración de Wirtz Coklin de acuerdo al protocolo que se detalla. - Cubrir toda la lámina con la solución acuosa de verde de malaquita al 5% - Calentar con el mechero hasta la emisión de vapores blancos en forma intermitente durante 5 minutos, restituyendo el colorante si es necesario, no dejar que se seque ni hervir. - Lavar con agua corriente. - Cubrir el frotis con solución acuosa de safranina al 0.75% durante 1 minuto. - Lavar con agua de caño. - Observar con el objetivo de inmersión. Lectura. Las esporas se observan de color verde y el cuerpo bacteriano (Bacilo) de color rojo. Observe y realice los esquemas

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COLORACION DE ZIEHL NEELSEN:

Muestra _____________100 X


COLORACION DE WIRTZ COKLIN

Bacillus subtilis 100 x

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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIÓN : Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos: - Han de contener las sustancias para el crecimiento del microorganismo que se siembra. - Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra. Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías: Físicos y químicos. Entre los primeros se incluye la temperatura, el pH y la presión osmótica; entre los requerimientos químicos se encuentra el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento. Objetivos Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo. Tipos de medios de cultivo Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos solo la adición de agua o la esterilización. Los medios de cultivo pueden clasificarse: Por el estado físico en que se encuentran. 1. Medios líquidos o caldos: Son aquellos que contienen disueltos en agua los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos. 2. Medios sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un agente solidificante (agar). El agente es un polisacárido complejo que se obtiene de algas rodoficias de origen marino cuyas propiedades son de gram utilidad en la preparación de medios de cultivo sólidos: No es degradado enzimáticamente por los microorganismos ( a excepción de algunos microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente en estado líquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45- 50ºC. Además, una vez solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se licué. Generalmente el agar se le añade, para solidificar un medio líquido, en una concentración del 1.5%. Los medios con agar se envasan en tubos o placas de Petri. Los medios de cultivo se utilizan con los siguientes fines:  Aislamiento de gérmenes a partir de un producto natural ( agua, alimentos) o de productos patológicos ( pus, orina secreciones).  Conservación de cepas.  Identificación de microorganismos, según la forma de crecimiento y caracteres de la colonia.

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 

Obtención de toxinas, elaboración de vacunas, etc. Obtención de toxinas y otros productos bacterianos.

3 Medios semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del agente solidificante en menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los microorganismos. Clasificación 1. Medios mejorados.- Son medios básicos y sustancias de valor nutritivo como sales inorgánicas, peptonas. Ejm. Agar sangre, agar suero etc. 2. Medios Selectivos..- Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás. Estos medio pueden contener un agente selectivo, como antibióticos, productos químicos, colorantes, pH. 3. Medios diferenciales.- Son aquellos medios, diseñados para distinguir unos microorganismos de otros, a partir de una población mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias, se les adiciona indicadores que ponen de manifiesto determinadas propiedades bioquímicas como: Gas, acidez, acción proteolítica. Ej. agar Mac conkey, TSI, agar urea, agar chapman, agar saboraud, etc. Preparación de medios de cultivo La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercialización de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo solo necesario la adición correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Se sigue los siguientes pasos para preparar medios de cultivo.  Pesar los ingredientes, agregar agua, calentar.  Ajustar el pH, repartir en tubos o frascos,  Esterilizar si el medio lo requiere, en autoclave a 121ºC, 15 libras de presión por 15 minutos.  Enfriar a 44ºC y repartir en placas petri, Los tubos con agar si es necesario inclinarlos, dejar solidificar y guardar en la refrigeración hasta su utilización.

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PRÁCTICA N° 3 ESTERILIZACIÓN INDUSTRIAL: MÉTODOS FÍSICOS QUÍMICOS Y RADIACIÓN La esterilización es la muerte, destrucción o eliminación de cualquier forma de vida, animal, vegetal, de tipo macroscópico, microscópico, sean los microorganismos nocivos o inócuos. Se esteriliza para:  Prevenir la infección de los hombres, animales y plantas.  Evitar la descomposición de alimentos y otros productos.  Evitar la interferencia por microorganismos contaminantes.  Para prevenir la contaminación de materiales usados en el trabajo, laboratorio, industrias.  Para adecuar material de vidrio como tubos, placas petry, probetas, pipetas etc.  Instrumental quirúrgico. OBJETIVO Adquirir experiencia en el manejo de equipos de esterilización y aplicar métodos y esterilización empleando distintos agentes físicos y químicos radiación. PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÓN A.

MÉTODOS FÍSICOS: ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO.  Esterilización por la llama directa. Produce la carbonización de los microorganismos y sus esporas.  Esterilización por aire caliente: (Estufa de esterilización, horno) El calor actúa como aire caliente a la temperatura de 165º - 170ºC por el tiempo de media hora, sirve para esterilizar objetos resistentes como material de vidrio, porcelana, instrumentos. ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO: Esterilización por ebullición: Utiliza agua en ebullición. No elimina esporas, es limitada su utilización. Esterilización por vapor fluente: (Thindalización) Consiste en calentamiento por vapor de agua discontinuo a 80 – 100ºC y refrigerado después, por tres veces con intervalo de 24 horas. Elimina gérmenes y esporas. Sirve para esterilizar medios que se descomponen por el calor a mas de 100ºC como carbohidratos, gelatina, leche suero. Esterilización por vapor de agua a presión: Autoclave, es el método ideal en el campo bacteriológico y seguro. Se basa en que el vapor de agua a presión es más caliente que el agua en ebullición o el vapor libre. Las condiciones de esterilización son 121ºC a 15 libras de presión por pulgada cuadrada por el tiempo de15 minutos. Sirve para esterilizar medios de cultivo, cultivos usados, material biológico.

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ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN Y CENTRIFUGACIÓN La filtración se realiza en medios líquidos, microorganismos en suspensión y un cuerpo poroso (filtro) semipermeable, separa gérmenes y miceleas orgánicas de los líquidos que los contienen. La centrifugación separa gérmenes del líquido en que se encuentran suspendidos, no es seguro, solo se emplea previo a la filtración. B. ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN Los principales tipos de radiación son las partículas y las ondas electromagnéticas de mayor longitud de onda como los rayos ultravioletas. Los rayos u.v. con una longitud de onda entre 2000 a 2540 Angstrom son de considerable uso para eliminar gérmenes en ciertos lugares como sala de operaciones, cuarto de siembra, gotitas de Flugge. La acción se produce sobre el ADN el cual junto con las proteinas absorbe las radiaciones produciendo la muerte o mutación de la bacteria. Su inconveniente es poco poder de penetración. C. MÉTODOS QUÍMICOS La muerte o inhibición de los gérmenes se consigue por sustancias químicas que actúan coagulando el protoplasma o interfiriendo el metabolismo bacteriano, tenemos: Halógenos y compuestos halogenados. Sales de metales pesados. Fenol. Compuestos amónicos cuaternarios. Gases microbicidas. Alcoholes.

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SIEMBRA DE MICROORGANISMOS. BACTERIAS

Sembrar es colocar a los microorganismos en medios de cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen en condiciones óptimas. Para sembrar es necesario: a. b. c. d.

Realizar la siembra en medios de cultivo apropiado y estériles. Trabajar cerca de la llama del mechero. Esterilizar a la llama el asa de Kolle, antes y después de la siembra. Flamear la boca del tubo, antes y después de realizada la siembra.

Los Tipos de Siembra son 1. Por Transplante 2. Por Aislamiento 1. Por transplante: El material contiene una sola especie bacteriana, y se realiza con la finalidad de conservar el microorganismo renovando su medio de cultivo ó para conocer sus propiedades biológicas y bioquímicas. 1. Siembra de una muestra líquida a un medio líquido. 2. Siembra de una muestra líquida a un medio sólido. 3. Siembra de una muestra sólida a un medio liquido. 4. Siembra de una muestra sólida a un medio sólido. PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3.

4.

5. 6. 7. 8.

Esterilizar el asa por flameado. Dejarla enfriar Tomar con la mano izquierda el tubo con la muestra dar leve inclinación para evitar, al ser destapado, contaminación con microorganismo del medio ambiente. Con la mano derecha, sostener el asa y ayudado con el dedo meñique de esta misma mano, sacar el tapón del algodón del tubo con la semilla. Flamear la boca del tubo, é introducir el ase sin tocar las paredes y cargarla con la suspensión o semilla. Retirar el asa. Flamear de nuevo la boca del tubo, y tapar con el algodón. Inmediatamente tomar con la mano izquierda el tubo con el medio de cultivo sólido estéril, destapar con cuidado de esterilidad é introducir el asa hasta el fondo, y apoyando la aguja sobre la superficie, hacer una línea o estría sin romper el medio de cultivo. Flamear la boca del tubo y el ase de Kolle. ANOTAR EL NUMERO DE MESA, LETRA DEL ALUMNO, MICROORGANISMO Y FECHA. Incubar en la estufa a 37 ºC por 48 horas. Transcurrido el tiempo se observa: a) En los medios líquidos, sedimento, enturbiamiento, película etc. b) Desarrollo característico del germen a lo largo de la estría, en los medios sólidos.

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ESQUEMA DE LA SIEMBRA EN AGAR INCLINADO

ALGUNAS CARACTERÍSTICAS DEL CRECIMIENTO EN CALDO

2. Siembra por Aislamiento: Procedimiento de Siembra por agotamiento en superficie de placa Petri: 1.

Se utiliza para el estudio bacteriológico de un producto patológico y en bacteriología sanitaria, muestras que contienen una mezcla microbiana.

2.

La finalidad de este desarrollo de cada microorganismo en colonias separadas, para que en este estado de pureza, se estudie la especie bacteriana mediante sus propiedades culturales y bioquímicas.

3.

Cargar el asa en el tubo con la muestra problema, siguiendo las indicaciones de esterilidad anotadas arriba.

4. 5.

6. 7.

Destapar la placa Petri, dejar la tape invertida sobre la mesa. Sostener la base del Petri (que lleva el medio sólido estéril) con la mano izquierda. Realizar la siembra con la asa del kolIe imprimiendo sobre la superficie del Agar un movimiento de zigzag, para distribuir el inóculo en forma conveniente. Tapar la placa y flamear el asa Incubar a 30C por 48 horas. Transcurrido el tiempo se deberá anotar las características culturales, forma borde y color etc.

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ESQUEMA DE MÉTODOS DE SIEMBRA EN PLACA

ALGUNOS CARACTERES CULTURALES DE LAS COLONIAS DE PLACA PETRI

RECOMENDACIONES:  

No exponer al aire libre la placa Petri, más del tiempo estrictamente necesario para “picar” la colonia. Asegurarse que la zona del Agar donde se enfría el asa, esté libre de todo cultivo.

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

“Picar” las colonias perfectamente aisladas, cuidando de no tocar más de una colonia por vez.

INOCULACIONES La observación microscópica; las características de cultivo; sirven para identificar al agente etiológico, sin embargo es indispensable también el estudio de las diferentes manifestaciones que presenta en un animal selectivo de experimentación. La inoculación a los animales de laboratorio se practica fundamentalmente con los siguientes fines: 1. 2.

3. 4. 5.

Para el reconocimiento de ciertas especies bacterianas procedentes de productos patológicos, como la investigación de bacilo tuberculoso en orina, esputo, etc. Aislamiento de una especie microbiana presente en un producto patológico, donde pueda encontrarse sola o mezclada con otras especies y debido a la selectividad del animal, se consigue al cabo de horas aislado de toda la flora, como por ejemplo: El neumococo. Cuando partiendo de un agente ya aislado se trata de comprobar las características de la acción patológica que presenta. Para la propagación del virus que no puede cultivarse. Para inmunizar animales y obtener sueros ú otros productos usados en bacteriología.

En todos los casos se debe tener en cuenta el poder patógeno, dosis y vía de inoculación. VÍAS DE INOCULACIÓN: Las vías de inoculación más comunes son 1. Subcutánea 2. lntraperitoneal 3. lntracardiaca 4. Intravenosa

5. 6. 7. 8.

Intramuscular lntracraneal lntradérmica Otras muchas.

PROCEDIMIENTO: Técnica de la inyección subcutánea: 1. 2. 3.

Se suele inyectar en la línea media de la pared abdominal ó en la ingle. El animal estará sujeto por un ayudante ó amarrado de modo seguro. Se esquila el pelo de la región en que se va a inyectar (ó se afeita si es necesario) se desinfecta con alcohol yodado al 2 %. 4. Se toma un pliegue de la piel entre los dedos índice y pulgar de la mano izquierda y la jeringa con la derecha, se introduce la aguja en el pliegue cutáneo, presionándola hasta que haya penetrado unos 2 á 3 cms. Se procura no penetrar en la cavidad peritoneal y se inyecta el líquido. 5. Se cubre el punto de inoculación con una compresa de algodón humedecida en alcohol yodado. Técnica de la inyección intraperitoneal: 1. Se esquila y se afeita el pelo de una zona de unos 5 cms de diámetro en la línea media abdominal, inmediatamente por debajo del ombligo. Se desinfecta. 2. Un ayudante sujeta firmemente al animal con la cabeza hacia abajo. 3. Asegurando bien la jeringa se introduce la aguja debajo de la piel, siguiendo con la corta distancia el eje longitudinal del animal en dirección a la cabeza; después por un movimiento de elevación de la mano se fuerza la aguja a través de la pared abdominal y peritoneo.

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4. La penetración estará indicada por la relajación de los músculos abdominales. Entonces se retira ligeramente la aguja y se práctica la inyección. Técnica de sangría por punción cardiaca: (También usada para inocular) 1. 2. 3. 4.

5.

Después de haber producido la agitación del animal, se coloca en el aparato de contención, ligeramente inclinado de arriba hacia abajo. Depilar la piel de la región precordial y desinfectarla. Elegir el punto de reparo para la inoculación : Tercer espacio intercostal, a 4 milímetros del borde izquierdo del esternón y a 4 cms del ángulo condro-xifoideo. Introducir una aguja No. 20 de 1 ½ pulgadas, adaptada a una jeringa de 10 á 20 ml; perpendicularmente a la superficie del corazón y a una profundidad aproximada de 1,5 á 2,0 cms. La aspiración de algunas burbujas de aire indica que la aguja está en el pulmón, retirar algunos milímetros hasta que la sangre aparezca en la jeringa. Vaciar con asepsia la sangre dentro de un tubo de centrífuga estéril.

Técnica de la inyección intravenosa: (También usada para sangría) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

La vena auricular posterior que corre a lo largo del borde externo de la oreja, se presenta mejor a este fin que las venas medianas o de otros órganos o . El animal ha de estar fuertemente sujeto porque el más ligero movimiento haría que la aguja atraviese la vena y hubiera que repetir la inyección. Se cortan los pelos si son demasiado largos. La oreja se frota suavemente con los dedos y se lava con alcohol yodado, se pasa un algodón con xilol; la fricción hará la vena más ostensible. Se coge la oreja por la punta y se estira hacia el operador o bien se la enrolla con suavidad sobre el índice izquierdo, manteniéndola sujeta con este dedo y el pulgar. La cantidad inyectada debe ser lo más reducida posible y la temperatura de la solución muy cercana al cuerpo. Tómese, la jeringa como si fuera una pluma é introduzca la punta de la aguja a través de la piel en la pared de la vena, hasta penetrar en la luz venosa. Se indicará al ayudante que cese la comprensión de la raíz de la oreja y se inyectará lentamente la solución. La aguja ha de extraerse con rapidez, colocando una pequeña torunda mojada en alcohol yodado sobre el punto de la inyección comprimiéndola fuertemente.

Técnica de la inyección intramuscular: 1.

Estas inyecciones suelen practicarse en los músculos posteriores del muslo o en los laterales abdominales o torácicos. 2. Se esquila el pelo, se desinfecta como para la inyección subcutánea. 3. Se fija la piel sobre los músculos elegidos, manteniéndose los dos pulgar é índice de la mano izquierda ligeramente separados y se introduce la aguja, se absorbe ligeramente para ver que no está en vaso sanguíneo y se inyecta lentamente. Técnica de la inoculación intradérmica: 1.

Cuando se trate de reacciones cutáneas, como pruebas de alergia etc, se elegirán animales blancos o, en otro caso, se procurará inyectar en zonas de piel clara. 2. Se empleará una jeringa de 1 mi con aguja No. 26. 3. Se prepara la piel; con dos dedos, se toma un pliegue cutáneo y se introduce la aguja, lo más superficialmente posible. La aparición de una mancha anémica blanca y prominentemente que ponga de manifiesto los orificios de los folículos pilosos, demostrará que la inyección ha sido bien practicada.

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PRÁCTICA N° 4 MÉTODO BACTERIOLÓGICO I: LABORATORIO DE ENTEROBACTERIAS. CULTIVO PRIMARIO INTRODUCCIÓN Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los requerimientos nutricionales y las condiciones Ambientales óptimas para su crecimiento. En un habitad, los seres vivos tambien interaccionan con el entorno físico y químico de dicho habitad. Los habitats difieren mucho en cuanto a características físicas y químicas y su habitad favorable para el crecimiento de un microorganismo puede resultar nocivo para otro. Además, los microorganismos pueden modificar las condiciones físicas y químicas de su entorno. Al realizar los procesos metabólicos los microorganismos extraen nutrientes del medio y los usan para hacer nuevas células. Al mismo tiempo excretan al medio los productos de desecho de su metabolismo. La mayoría de microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para estudiar los microorganismos y sus propiedades, es necesario separar unos de otros y obtener especies aisladas y por lo tanto se tendrá cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismos y que procede de una sola célula; el crecimiento de esta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visibles que recibe el nombre de colonia y se utiliza las llamadas técnicas de aislamiento. La finalidad del aislamiento es conseguir el desarrollo de microorganismos en colonias separadas y que se puedan estudiar sus propiedades culturales y bioquímicas. OBJETIVO : Aislamiento y posterior identificación de distintas especies bacterianas a partir de diferentes muestras . Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de aislamiento en placas de petri. Obtener colonias separadas, obteniendo diferentes métodos. Estudiar los caracteres culturales de cada colonia. MUESTRA Se puede obtener muestra de agua, alimentos, bebidas gaseosas, chicha, orina, heces, secreciones, etc. ,estas muestras debe ser representativa; tomada de un lugar adecuado y la cantidad suficiente y en condiciones de esterilidad con recipientes, envases o tubos estériles. MATERIALES Muestras de agua de rio, chicha, orina, heces, secreción faringea y nasal. Placas de agar Mac Conkey, agar Sangre, agar Staphylococcus. Cultivos con Enterobacterias y Estafilococos Pruebas bioquímicas TSI, LIA INDOL. Prueba de la Catalasa

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Coloración de Gram. Microscopio Mechero bunsen, asa bacteriológica. Aceite de inmersión, láminas portaobjetos. PROCEDIMIENTO Siembra a ) Extensión en superficie con cayado Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota ó 0.1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, ala temperatura deseada, durante 24, 48 ó 72 horas, según el tipo de microorganismos. Esta técnica es usada para el aislamiento de colonias, que permite el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado. Para realizar el recuento después de la incubación, se cuentan las colonias y se expresa el resultado en UFC/ml de muestra

Siembra por extensión en superficie b ) Estría multiple en superficie Con una asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra de cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías . Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría, Se lleva la placa a incubar a la temperatura adecuada. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado números de bacterias Para realizar el recuento, se cuentan las colonias y se expresa el resultado en UFC/ de muestra

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Aislamiento por estría en superficie

c) Dilución en masa En una placa petri vacia estéril se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo ( agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para determinar el número de microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o microaerófilos. d )Método de los tubos múltiples Método del Número Mas Probable (NMP) Mediante el método de los tubos múltiple o número más probable (NMP) se puede determinar el número de microorganismos a partir de diferentes tipos de muestras ( aguas, suelo, etc) a partir de una muestra sembrando distintos volúmenes de la muestra a analizar o diluciones decimales obtenidas a partir de ésta, en series de tres o cinco tubos que contienen medio de cultivo líquido. Este método sirve para analizar aguas, bebidas gaseosas, leches, carnes, etc.

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RESULTADO Después de heber incubado las placas por 24 hr o más, a 37ºC realizar el recuento de bacterias y expresarlo e UFC/ml de muestra

Recuento por extensión en superficie

Recuento por estria múltiple en superficie

Recuento por dilución en masa

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PRÁCTICA N° 5 MÉTODO BACTERIOLÓGICO II. ESTUDIO DE LOS CARACTERES CULTURALES. SIEMBRA EN MEDIOS BIOQUIMICOS LABORATORIO DE ENTEROBACTERIAS INTRODUCCION Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los requerimientos nutricionales y las condiciones ambientales óptimas para su crecimiento. En un habitad, los seres vivos también interaccionan con el entorno físico y químico de dicho habitat. Los habitats difieren mucho en cuanto a características físicas y químicas y su habitad favorable para el crecimiento de un microorganismo puede resultar nocivo para otro. Además los microorganismos pueden modificar las condiciones físicas y químicas de su entorno. Al realizar los procesos matabólicos los microorganismos extraen nutrientes del medio y los usan para hacer nuevas células. Al mismo tiempo excretan al medio los productos de desecho de su metabolismo. El método bacteriológico es el camino que hemos de seguir para identificar al microorganismo desconocido que forma parte de la muestra problema, cuyo punto de partida es la toma de muestra TOMA DE MUESTRA La correcta recolección de muestra para realizar el método bacteriológico, es indudablemente la fase más importante en el aislamiento de microorganismos, materia de investigación. Ya que una muestra deficientemente recolectada, puede ser el fracaso en la identificación del microorganismo buscado. Una muestra debe ser representativa, tener presente el momento adecuado, la cantidad adecuada, empleando recipiente y dispositivos debidamente esterilizados y rotulados, Las muestras pueden ser diversas (agua, alimentos, tierra, vegetales, tejidos, secreciones, muestras patológicas, etc.) el método tiene ligeras variantes, pero en el fondo tiene una sola finalidad, cuál es la de identificar al microorganismo, ya sea este beneficioso o perjudicial. Objetivo Realizar en forma correcta el método bacteriológico y su posterior identificación de microorganismos con pruebas bioquímicas, para cualquier tipo de muestra. Materiales Muestra de heces. Placas con agar Desoxicolato citrato Agar TSI, LIA, agua de peptona Caldo selenito. Asa bacteriologica de siembra Microscopio Coloración de Gram Aceite de inmersión Láminas porta objetos. Cary-Blair

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Método bacteriológico de una muestra de agua contaminada Procedimiento Toma de muestra: Con un hisopo o torunda, se sumerge en el frasco de agua contaminada, esperando unos segundos, con la finalidad de coger microorganismos hasta que se impregne de microorganismos. Luego se procede al cultivo en el laboratorio El hisopo previamente lubricado en el medio de Cary- blair, se introduce en el recto del paciente unos 2 a 2.5 cms. Realizando movimientos rotatorios suaves, con la finalidad de coger microorganismos de la ampolla rectal, se extrae y se coloca en el centro del tubo de Cary-Blair, se tapa y ya esta tomada la muestra, se lleva en la brevedad posible al laboratorio. En el laboratorio: 1. Se enciende el mechero. 2. Girando el hisopo y haciendo movimientos rotatorios dejar una pequeña porción de muestra en un extremo del medio de cultivo Mac Conkey (MC) o Dexocicolato citrato (DC).. 3. Tomando como referencia el lugar de inoculación de la muestra, distribuir uniformemente con el asa hacia ambos extremos, según el trazo indicado en la figura. 4. Continuar la siembra, distribuyendo con el asa. De uno de los extremos de la primera porción y en ángulo recto hasta el otro extremo, conservando el ancho de los 2 cm. 5. Siguiendo el mismo sentido, distribuir la tercera porción © 6. Continuar la siembre en la parte central, con trazo en zig-zag, sin tocar los lados de las siembras anteriores (d) 7. Esterilizar el asa. 8. El hisopo del paso Nº 3 colocar dentro del tubo que contiene medio líquido (caldo de selenito) 9. Rotular tanto la placa (MC, DC) como el tubo de caldo de selenito. Con lápiz de cera. 10. Poner a incubación a 37ºC por 24 ´0 28 horas, ambos cultivos.

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ESTUDIO DE LOS CARACTERES CULTURALES. SIEMBRA EN MEDIOS BIOQUIMICOS INTRODUCCION Luego de haber realizado el método bacteriológico I e incubado a 37ºC por 24 horas, se procede a la observación de las diferentes características que pueden presentar los microorganismos presentes en una muestra problema, tales como: caracteres culturales de las colonias, tamaño, morfología, tipos de agrupación de los microorganismos, reacción a la coloración de Gram, Caracteres metabólicas, bioquímicos y serológicas; siendo nuestra finalidad la identificación de los microorganismos.

1. EN MEDIO SOLIDO.  Forma:



Borde:

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

Elevación:

Plana  

Superficie: Lisa, rugosa, mate brillante, húmeda, seca. Consistencia: cremosa pastosa, viscosa, compacta, membranosa, seca.



Opacidad: Transparente opaca.



Color: Incoloro, blanco, gris, amarillo, rosado, amarillo, verdosa, azules. negras.



Tamaño: Desde puntiforme a unos centímetros. Se mide el diámetro en milímetros.



Hemólisis: Ausente, presente parcial o total.

SIEMBRA EN MEDIOS BIOQUIMICOS Inoculación en Agar TSI; LIA, Caldo peptonado -

Encienda el mechero y esteriliza el asa de siembra. Picar o coger la colonia aislada y seleccionada, teniendo sumo cuidado de no tocar el medio de cultivo. Inocular en tubo del TSI en forma vertical hasta el fondo del tubo, extraer la aguja hasta parte inclinada del agar y sembrar en forma de zig-zag sobre la superficie del bisel, extaer la aguja, tapar el tubo. Con la misma aguja inocular en el medio de LIA punzando tres veces en sitios diferenciales como formando un triángulo y en la tercera extensión hasta el límite del medio con el aire, realizar zig-zag. Inocule el remanente de las bacterias que quedaron adheridas a la aguja bacteriológica introduciendo en el caldo peptonado agitando vigorosamente, se extrae la aguja y recién se esteriliza el asa de siembra Se rotulan los tres tubos y se incuban a 37ºC por 18 a 24 horas.

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PRACTICA Nº 5 METODO BACTERIOLOGICO II: CARACTERES CULTURALES DE LAS COLONIAS RESULTADOS 1. ESQUEMATICE LA MUESTRA DE DESARROLLO EN MEDIO LIQUIDO:

2. ESQUEMATICE LAS CARACTERISTICAS DE DOS COLONIAS DE LAS MUESTRAS EN PLACA DE AGAR.

3. EXAMEN MICROSCOPICO: Coloración de Gram.

Muestra colonia de_____________

Muestra colonia de________________

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PRACTICA N° 5 CONTINUACION: MÉTODO BACTERIOLÓGICO III LECTURA SIMBOLIZACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS INTRODUCCIÓN Las bacterias para reproducirse y sintetizar su citoplasma pone en actividad, en los sustratos nutritivos donde se los coloque acciones enzimáticas, las que se comprueba su actividad bioquímica frente a los hidratos de carbono, proteínas o grasas OBJETIVO Realizar la lectura de las pruebas bioquímicas de algúnas especies bacterianas de origen entérico. MATERIALES Cultivos en medio agar TSI. Cultivos en medio agar LIA Cultivos en medio caldo de peptona. Reactivo de Kovacs. Gradillas. PROCEDIMIENTO 1. El tubo en agar TSI (triple azúcar hierro) contiene glucosa, sacarosa, lactosa. La degradación del azúcar con formación de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo, o por un viraje a rojo intenso en caso de alcalinización. Cuando hay acidez se simboliza con la letra “A”, cuando hay alcalinidad, se simboliza con la letra ·”K”. El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a ácido sulfhidrico, el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color negro, se simboliza en cruces. 2. La lectura del agar LIA, es descarboxilada por microorganismos que transforman en amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol, la descarboxilación tiene lugar en medio ácido y es debido a la fermentación de la glucosa, se simboliza K/K. Los microorganismos lactosa negativos, pero fermentadores de glucosa produce un viraje al amarillo en la totalidad del medio de cultivo. La incubación prolongada puede ocasionar una alcalinización en la superficie del medio y en consecuencia produce un viraje al violeta. La formación de H2S produce una coloración negra debida al sulfuro de hierro. Se simboliza K/A. Las cepas del grupo Proteus y Providence, desaminan a la lisina a ácido alfacetocarbónico. Este último forma compuestos pardo-rojizos en la región superficial del medio de cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno. Se simboliza R/A.

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3. La prueba del indol: añadir al tubo con cultivo en caldo de peptona una gota del reactivo de Kovacs: Reacción positiva anillo rojo. Reacción negativa, anillo amarillo.

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PROCESO BACTERIOLÓGICO III. LECTURA SIMBOLIZACIÓN E INTERPRETACION DE LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS RESULTADO

CARACTERES BIOQUIMICOS TSI

LIA

INDOL

CITRATO

MICROORGANISMO

HAGA ESQUEMA o DIBUJE LOS TUBOS CON LAS DISTINTAS REACCIONES

COLONIA ENTEROBACTERIAS

ESCHERICHIA COLI

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Col. Gram Aumento 1000 X

STAPHYLOCOCCUS



STREPTOCOCCUS


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PRÁCTICA N° 6 MUTACIÓN GENÉTICA POR RADIACIÓN MUTACIÓN GENÉTICA INTRODUCCIÓN: Una mutación es un cambio hereditario en la secuencia de bases del ácido nucleíco genómico de un organismo. en todas las células, este ácido nucleico es DNA. Una cepa que lleva este tipo de cambio se denomina mutante. Por definición, un mutante difiere de su cepa parental en el genotipo, es decir la secuencia exacta de nucleótidos ene el DNA genómico. Además, las propiedades observables del mutante, su fenotipo, también pueden estar alterados con respecto ala cepa parental. Las mutaciones originan cambios fenotípicos en el organismo, en la mayor parte de los casos estos cambios son perjudiciales, pero ocasionalmente ocurren también cambios que son beneficiosos. Las mutaciones pueden ser espontáneas o inducidas. Las mutaciones espontáneas pueden ocurrir como consecuencia de la acción de la radiación natural (por ejemplo, rayos cósmicos) que alteran la estructura de las bases del DNA durante la replicación. El tipo mas frecuente de radiación UV que se usa para mutagénesis es la lámpara microbicida que emite grandes dosis de radiación UV en la región de 260 nm. Se suele utilizar una dosis de radiación UV que produce un 90 – 95% de muerte en la población bacteriana. La radiación UV es muy útil en el aislamiento de mutantes de cultivos bacterianos. OBJETIVO Observar los cambios que se producen en los hongos a diferentes tiempos de exposición a la lámpara de luz ultravioleta. MATERIALES Cultivo de hongos filamentosos del género Aspergillus y Penicillium Placas con cultivo de Escherichia coli Tubos de ensayo con diluciones Guantes Barbijo Gorro Placas con agar saboraud Lámpara de luz ultravioleta Lentes oscuros PROCEDIMIENTO Para la extracción de las conidias de hongos y colonias de bacterias agregar agua no clorada y humectante (Tween 80 al 0,05%) a la placa y raspar con un asa metálica. Esta suspensión homogenizar en un agitador magnético durante 5 min, al cabo de los cuales se determina la concentración de conidias de hongos y colonias de bacterias, mediante nefelómetro de Mac Farland correspondiente al tubo N°1 que equivale a 300 millones de m.o por ml. Extraer alícuota (1 mL) y esparcir con una jeringa en placas Petri (Æ = 55 mm, altura 13 mm) con medio agar-nutritivo al 2%, con un espesor menor a 4 mm. La exposición de las esporas y bacterias a la luz UV se coloca las placas destapadas a 50 cm de distancia

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vertical de una lámpara de mercurio de 30 W (Philips, modelo TUV 30, Holanda), que emitía luz ultravioleta de l = 254 nm. La exposición se realiza a intervalos de tiempo: 1 minuto, 5 minutos 10 minutos 20 minutos, 30 minutos Una vez cumplido el tiempo de exposición, las placas se retiraron de la cámara, se taparon y sellaron. Posteriormente, se mantuvieron en oscuridad en una sala a 20°ara los hongos. Para las bacterias ponerlas en la incubadora por 24 hrs a 37°C.

MUTAGÉNESIS POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA. Fundamento. La obtención de células mutantes de muy diversos microorganismos tiene una tremenda importancia tanto en el campo industrial, con objeto de mejorar determinadas características en una cepa concreta, como en investigación básica. Dado que las mutaciones espontáneas ocurren en una proporción muy baja, cuando se pretende obtener mutantes de una población microbiana las células se someten a tratamientos mutagénicos con objeto de aumentar la frecuencia con la que acontecen estas mutaciones. De esta manera podemos incrementar hasta 100 veces la frecuencia de las mutaciones sin provocar unos valores de muerte celular excesivamente elevados y sin que aparezcan dobles mutantes con una frecuencia significativa. Frente a la mutagénesis química, la inducida por radiaciones ofrece la ventaja de una manipulación más cómoda. En esta práctica, someteremos a un cultivo de E. coli a un tratamiento mutagénico con radiación ultravioleta, la cual altera fundamentalmente el DNA por la formación de dímeros de pirimidinas. El recuento de células viables tras dicho tratamiento nos servirá para determinar la agresividad del proceso y para poder averiguar cuales serían las condiciones óptimas para llevar a cabo una búsqueda de mutantes en la cepa utilizada en la práctica. Microorganismos utilizados. Se utilizan las cepas Escherichia coli GY752 (RecA+) y Escherichia coli GY754 (RecA-) Medios de cultivo. LB: Triptona .......................................................................10 g. Extracto de levadura .................................................... 5 g. ClNa ....................................................................... 10 g. Agua destilada ............................................................. c.s.p. 1000 ml. Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 0,1 N. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. LB SOLIDO: Añadir agar al 2% a la formulación del medio LB. Procedimiento: 1ºDIA.- A partir de un cultivo de DO 0.1 (108 células/ml) de cada cepa se hacen diluciones decimales seriadas. De la dilución 10-4 se siembran 100 μl por extensión en superficie con pipeta Pasteur estéril en forma de cayado, en dos placas de LB. Cada grupo de trabajo someterá a ambas placas sembradas a una dosis diferente de radiación UV de una longitud de onda de 254 nm (0, 10s, 20s, 40s, 60s, 80s, 100s, 2m, 3m, 5m). La lámpara de UV está ajustada a una distancia tal que se producen 4 erg/mm/segundo. 54

Incubar las placas en oscuridad a 37ºC (con el fin de evitar el fenómeno de fotorreactivación). 2º DIA.Determinar mediante recuento de colonias la concentración de células viables antes y después del tratamiento mutagénico. RESULTADOS

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56

PRACTICA N° 6

LABORATORIO DE COCOS GRAM POSITIVOS I.- INTRODUCCION El Género Staphylococcus se halla ampliamente distribuido en la naturaleza, se encuentra en las mucosas, ropa alimentos, tierras, agua. En el ser humano se halla en la piel, mucosa naso faringea, intestino. El género Streptococcus se encuentra repartido en el ambiente, leche, agua, polvo, pero también se le encuentra en la boca, intestino del hombre y animales. Muchas especies son saprofitas. STAPHYLOCOCCUS Son cocos Gram positivos agrupados en racimo de uva, crecen fácilmente, producen pigmento que va desde el blanco hasta el amarillo intenso. El mas importante es Staphylococcus aureus, da beta hemólisis, pigmento dorado, coagulasa positivo y causa enfermedades en el hombre como infecciones purulentas, abcesos, supuraciones, intoxicación alimentaria. Staphylococcus epidermidis, integrante de la flora de la piel y mucosas, causa infecciones oportunistas, da alfa hemólisis, no produce pigmento dorado. STREPTOCOCCUS Son cocos Gram positivos en forma de cadena o forman parejas, son gérmenes delicados y solo crecen en medios enriquecidos o especiales como el agar sangre, agar azida. Producen enfermedades post estreptocócicas, fiebre reumática, glomerulonefritis. Streptococcus piógenes (grupo A), produce beta hemólisis en agar sangre y es el principal patógeno para el hombre. Streptococcus viridans, produce alfa hemólisis. NEUMOCOCOS Streptococcus pneumoniae, diplococo Gram positivo lanceolado con cápsula, compuesta de polisacáridos, habita el aparato respiratorio superior humano y causa neumonías, sinusitis, otitis, etc. II.- OBJETIVOS Identificar los agentes infecciosos Observar su morfología. Observar los caracteres culturales de las colonias. 57

III.- MATERIALES - Secreción faringea y nasal - Hisopos - Láminas coloreadas - Cultivos - Asas, mecheros, aceite de inmersión.

- Coloración de Gram - Baja lenguas - Microscopios - Placas petri con agar

IV.- PROCEDIMIENTO Se procede a identificar especies del género Staphylococcus y Streptococcus de una muestra de secreción faríngea o nasal. (patológica). Tomar la muestra con hisopo y baja lengua de la faringe y con un hisopo, muestra de secreción nasal. Cultivar la muestra en agar Sangre, agar Chapman , incubar a 37º C por 24 horas. Después de haber puesto la muestra en los diferentes medios de cultivo, hacer un frotis de la secreción y colorarlo con la Coloración de Gram. Después de haber cultivado 24 hrs. observar sus caracteres culturales. Hacer esquemas PRODUCTO PATOLOGICO Secreción Nasal

Col Gram Aumento 1000 X

PRODUCTO PATOLOGICO Secreción Faringea


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LAMINA COLOREADA (STOCK) STAPHYLOCOCCUS

Col. Gram

COLONIA STAPHYLOCOCCUS

STREPTOCOCCUS

Col Gram

NEUMOCOCO

Col. Gram

COLONIA DE STREPTOCOCCUS

Col. Gram

Col. Gram

Aumento 1000 X

Aumento 1000 X

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PRÁCTICA N° 7

EXAMEN MICROBIOLOGICO DEL AGUA:

ANALISIS CUALITATIVO DETERMINACIÓN DEL NMP DE GÉRMENES COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES FECALES POR EL MÉTODO DE TUBOS MÚLTIPLES DE FERMENTACIÓN 1.

OBJETIVO: Ejecutar correctamente el análisis cualitativo de una muestra de agua.

2.

MATERIALES: Muestra de agua Caldo lauril sulfato Agar EMB Pipetas de 10 ml. 5 ml. y 1 ml. respectivamente Gradillas Lápiz para marcar vidrios Mechero de gas

3. PROCEDIMIENTO: Determinación de Coliformes Totales. a) Prueba Presuntiva: Consiste en la inoculación de una cantidad determinada de la muestra de agua en tubos de fermentación que contienen un medio de cultivo apropiado, examinando al cabo de determinado tiempo de incubación las reacciones provocadas por los organismos coliformes. Este examen es denominado presuntivo a causa de que las reacciones observadas pueden ser provocadas por otros organismos no coliformes, por lo que la presunción de que la reacción es debido a organismos coliformes debe ser confirmada. Se utilizó Caldo Lauril Sulfato en volúmenes de 10 ml de concentración simple (X) para inóculos de 1ml de muestra, y 10ml de doble concentración (2X) para inóculos de 10ml. El frasco de la muestra con movimientos constantes se agitará para homogenizar la muestra de agua, luego se retirará 1ml utilizando una pipeta esterilizada y se transferirá a un tubo de ensayo que contendrá 9ml de agua tamponada de dilución, se tendrá una dilución al décimo de la muestra 61

(10-1) que debe ser bien homogeneizada; con otra pipeta estéril se retirará 1ml de la primera dilución y se pasará a otro tubo con agua de dilución con lo que la muestra original es diluida al centésimo (10-2) y así sucesivamente hasta llegar a la dilución conveniente. Cada tubo de ensayo tendrá su correspondiente campana de Durham o fermentación y en grupos de 5 tubos. Se pipeteará 10ml del frasco de la muestra de agua en los tubos que contienen el Caldo Lauril Sulfato de doble concentración de 10ml c/u; nuevamente con la misma pipeta se retirará 1ml del frasco de la muestra

y se transferirá a otros cinco tubos de ensayo que

contendrán 10ml de Caldo Lauril Sulfato de simple concentración. Empleando la dilución (10-1) como muestra, que será bien agitada y con otra pipeta estéril se retirará 1ml y se transferirá a cinco tubos que contienen Caldo Lauril Sulfato de simple concentración; se continuará la serie con la siguiente dilución (10-2), esta también será agitada e inoculada en tubos de fermentación de Caldo Lauril Sulfato de simple concentración. La serie continuará hasta que la dilución final rinda resultados negativos (ver Anexo Nº2). Luego de inoculada la muestra en los tubos de ensayo se incubará a 37ºC por 24 – 48 horas. Al cabo de las 24 horas de incubación los tubos serán examinados, si no se ha producido gas se vuelve a examinar a las 48 horas. En los tubos positivos se observará la producción de gas, como resultado de la fermentación se enturbia el caldo y agitando suavemente y por movimientos de rotación se observará la aparición continua de pequeñas burbujas de gas en el medio; se seleccionarán los tubos positivos para la prueba confirmativa y se procederá con la siguiente etapa. (Ver Anexo Nº1) b) Prueba confirmativa: Consiste en la confirmación de la presencia de organismos coliformes y E. coli que al crecer sobre medios selectivos eliminan los resultados de la prueba presuntiva, y se realiza mediante subcultivo de cada tubo positivo en medios de confirmación líquidos o sólidos.

62

Para esta prueba se utilizará tubos de fermentación que contendrán Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis (Brila) y en su interior un tubo Durham invertido; y a partir de los tubos positivos de Caldo Lauril Sulfato (los tubos que presentan formación de gas y acidez), se extraerá con un asa de siembra dos asadas y se inoculará en Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis, terminada la siembra se incubará a 37ºC por 24 - 48 horas para determinar la presencia de bacterias coliformes totales, luego del periodo de incubación, la prueba será considera positiva si se presenta la producción de gas y acidez. (Ver Anexo Nº 2) Para la prueba confirmativa, en algunos casos también se usarán placas de Agar Eosina Azul de Metileno (EMB); y a partir de los tubos positivos (presencia de gas y acidez) del Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis, se sembrará con un asa bacteriológica en las placas de EMB y se incubará por 24 horas a 35ºC. Se calcula el NMP basándose en las combinaciones de tubos positivos y negativos, ver anexo N° …4… reportando los resultados como Coliformes Totales /100ml.

después de realizar la conversión aplicando la siguiente

fórmula: Valor de la tabla NMP x 10

= NMP/100 ml

Volumen de la dilución inicial Ejemplos: 44 x 10 NMP = ---------------- = 440 x 10-2 = 4.4 x 104 / 100ml 10-2 240 x 10 NMP = ---------------- = 2400 x 10-3 = 4.4 x 107 / 100ml 10-3 c)

Prueba complementaria:

Cuando es exigida o aconsejable una prueba completa, algunas de las colonias aisladas en los medios de confirmación sólidos o aquellas obtenidas en uno de

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estos medios por resiembra de los tubos positivos en medio de confirmación líquidos, se inoculan en placas de Agar. A las 24 horas se observará colonias positivas, las colonias típicas (colonias rosado oscuras, con un núcleo central, con o sin brillo verde metálico) o las colonias atípicas (colonias rosado mucoides, opacas sin núcleo), las colonias negativas son transparentes. Para la confirmación de coliformes exige un aislamiento e identificación de las colonias desarrolladas en el medio EMB (Gonzales, 2004; Cruz et al., 2006), para ello se seleccionarán colonias típicas y atípicas, y se inoculará en TSI (triple sugar iron), LIA (agar lisina-hierro) e Indol; estas se

incubaron a 37ºC por 24 horas. Transcurrido ese tiempo se podrá

identificar el tipo de bacteria presente en las muestras de agua. (Ver pág. 97 - 98) Determinación de Coliformes Termotolerantes Para determinar la presencia de Coliformes Fecales se utilizará tubos de fermentación que contienen Caldo EC y en el interior del tubo de ensayo se colocará un tubo de Durham invertido. A partir de los tubos que presentarán gas y acidez en el Caldo Lauril Sulfato (Prueba Presuntiva) se tomarán dos asadas con el asa bacteriológica y se inoculará en tubos de fermentación que contienen Caldo EC, luego se incubará a 44.5ºC por 24 horas en Baño Maria con tapa para que mantuviera una temperatura estable y homogénea. Pasadas las 24 horas, los tubos se retirarán del Baño Maria y se observará la producción de gas y turbidez (ver Anexo Nº1).

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ANEXO Nº 1 FICHA DE CAMPO – LABORATORIO (AGUA de CANALES, RIOS. ETC.) Localidad: _____________________________________________________________________ Nº de Muestreo:________________ Coordenadas Geográficas: LS______________________ LO______________________ Distrito:_______________ Provincia:____________________ Dpto:______________________ Fecha:______________________ Hora de muestreo:__________________________________ Nombre del muestreador: ________________________________________________________ pH: ____________________________ Tº del agua:_____________________________________

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA FERMENTACIÓN EN TUBOS MULTIPLES TIEMPO DE INCUBACIÓN

DILUCIONES

PRUEBA PRESUNTIVA (24 – 48 hrs) PRUEBA COLIFORME TOTAL (24 – 48 hrs) CONFIRMATIVA

COLIFORME FECAL (24 – 48 hrs)

RESULTADOS N.M.P. COLIFORME TOTAL/100ml

TSI

N.M.P. COLIFORME FECAL/100ml

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS (OPCIONAL) PRUEBAS BIOQUIMICAS LIA CITRATO INDOL

RESULTADO

ANEXO 2 DIAGRAMA DE FLUJO: Detección de Coliformes Método del NMP

65

66

67

ESQUEMATICE

68

TABLA DEL NUMERO MAS PROBABLE DE MC GRADY TUBOS 3 Tubos de 10 ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3

POSITIVOS 3 tubos de 1.0 ml 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 0

INDICE DEL NMP POR 100 ml 3 tubos de 0.01 ml 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0

3 6 9 3 6 9 12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 27 11 15 7 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29 9 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23

LIMITES DE

CONFIANZA

Inferior

Superior

5

13

0.5

20 21 0.5 1

1 3

23 36

36

3

36 37 1 3

3 7

44 89

47 150

4 10

69

TUBOS 3 Tubos de 10 ml 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

POSITIVOS 3 tubos de 1.0 ml 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

INDICE DEL NMP POR 100 ml 3 tubos de 0.01 ml 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100

LIMITES DE

CONFIANZA

Inferior

Superior

4 7 15

120 130 380

7 144 30 15 30 35

210 230 380

36 71 150

380 440 470 1300 2400 4800

A partir del número de tubos que dan reacciones positivas en los medios presuntivos y confirmativas, calcular por referencia a las tablas estadísticas (ver tabla) el número mas probable de organismos coliformes, fecales (termotolerante) y E. coli presuntiva en 100 ml de muestra. Cuando se emplean diluciones, el resultado final deberá multiplicarse por el factor de dilución para hacerlo equivalente.

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Tabla del Número Mas Probable (NMP) por gramo o mililitro utilizando tres series de tres tubos cada una conteniendo 10 ml. de medio líquido y sembrado 1 ml. De la dilución 1:10; 1ml. de la dilución 1:100 y 1 ml. de la dilución 1: 1000 3 tubos 1ml.1:10

3 tubos 1 ml. 1:100

3 tubos 1ml.1:1000

NMP de Gérmenes g. o ml

0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3

0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3

<3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 240 1.100 >2.400

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Tabla del Número Mas Probable (NMP) por gr. o ml. utilizando tres series de cinco tubos cada una conteniendo 10 mililitros de medio líquido y sembrando 1 ml. de la dilución 1:10; 1 ml. de la dilución 1: 100 y 1ml. de la dilución 1:1000 5 tubos 1 ml. 1:10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

5 tubos 1 ml. 1: 100 0 0 0 1 1 1 2 2 3 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 3 3 4 4

5 tubos 1 ml. 1:1000 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 0 1 0 1

NMP de gérmenes gr. o ml. 0 2 4 2 4 6 4 6 6 2 4 6 8 4 6 6 6 8 10 8 10 11 5 7 9 12 7 9 12 9 12 24 12 14 15 8 11 13 11 14 17 20 14 17 20 17 21 21 24

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3 4 4

5 0 0

0 0 1

25 13 17

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 5 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 1 0 3 4 0 1 2 3 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

21 25 17 21 26 22 26 32 27 33 39 34 40 41 48 23 31 43 58 76 33 46 63 84 49 70 94 120 148 177 79 109 141 175 212 253 130 172 221 278 345 426 240 348 542 920 1.600 > 1.600

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REALIZAR ESQUEMAS

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PRÁCTICA N° 8

MICROSCOPIA DE BACILOS GRAM POSITIVOS BACILLUS AEROBIOS Y ANAEROBIOS ESPORULADOS INTRODUCCIÓN El género corresponde a bastones rectos esporulados aerobios que viven o sobreviven en el medio ambiente, algunos son patógenos para artrópodos. La especie Bacillus anthracis produce el carbunco, enfermedad infecciosa propia de varias especies de animales, especialmente herbívoros. Es trasmisible al hombre. Estos organismos resistentes se desarrollan bien en los medios comunes de laboratorio. Bacillus cereus es un bacilo aerobio Gram positivo formador de esporas, responsable de intoxicaciones alimentarias, su habitad natural el suelo, contamina con frecuencia cereales, leche, budines, cremas pasteurizadas y especias, entre otros alimentos. La intoxicación alimentaria puede ocurrir cuando los alimentos son preparados y mantenidos sin la adecuada refrigeración durante horas antes de ser servidos. La intoxicación alimentaria es de dos formas. El sindrome emético esta producido por una toxina preformada y termoestable, se asocia por consumir platos de arroz frito contaminado, tiene periodote contaminación corto, produce náusea y vómito. La toxina que ocasiona la forma emética es una enterotoxina estable al calor. El síndrome diarreico por el contrario, esta producido por la ingestión de alimentos inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulación del organismo in vivo y la producción de una enterotoxina diferente de la anterior, preformada y termolábil y tiene un periodo de incubación mas largo que promedia entre 10 y 12 horas. OBJETIVO Observar estructuras que poseen las bacterias como las esporas, mediante coloraciones especiales. Coloración de Wirtz – Coklin. Observar caracteres culturales y bioquímicos. -

Materiales. Placas petri con agar nutritivo Placas petri con agar sangre Tubos de ensayo 10 x 150 con agar nutritivo y sembrado con Bacillus para la prueba de la Catalasa. Microscopio Láminas porta objetos. Mechero bunsen. Asa de Kolle Aceite de inmersión. 78

-

Colorante Verde de Malaquita. Mechero de alcohol. Frasco con agua oxigenada. Pipeta Pasteur.

Procedimiento: Efectuar la coloración de Gram del medio de cultivo para observar la presencia de hemólisis. Hacer esquema. Estudiar los caracteres culturales de las colonias y observar la presencia de hemólisis. Hacer esquema. Hacer frotis y efectuar la coloración de Wirtz Coklin para ubicar la presencia de la espora. En el tubo con agar inclinado conteniendo a la bacteria, agregar unas gotas de Peroxido de Hidrógeno ( agua oxigenada), observar lo que ocurre.

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PRACTICA Nº 8 BACILOS GRAM POSITIVOS: BACILLUS AEROBIOS ESPORULADOS RESULTADOS 1.- EXAMEN MICROSCOPICO: Coloración de Gram

Muestra ……100x

Muestra ….100x

2.- ESQUEMATICE LOS CARACTERES CULTURALES DE LAS COLONIAS Y PRESENCIA DE HEMÓLISIS

3.- EXAMEN MICROSCOPICO: Coloración de Wirtz Coklin

Muestra ………….100 x

Muestra ……………100 x

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PRACTICA N° 9 OBTENCIÓN DE ADN INTRODUCCION La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separado de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico, probablemente el único reactivo de esta práctica que no suele haber en una cocina. MATERIAL Y REACTIVOS  Muestra vegetal  Agua (destilada o mineral)  Sal de mesa  Bicarbonato sódico  Detergente líquido o champú  Alcohol isoamílico a 0ºC

 Batidora  Nevera  Colador o

centrífuga  Vaso  Tubo de nsayo  Varilla fina

REALIZACIÓN 1. Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo triturado: o 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo. o 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura. o 5 g de bicarbonato sódico. o 5 ml de detergente líquido o champú. 2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber en la cocina (cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos. 3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción del detergente. 4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante. 5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón. 6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un

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minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado. RESULTADOS El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN.

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PRACTICA N° 10 MÉTODO MICOLÓGICO I : MUESTRAS, MICROSCOPÍA, CULTIVO SIEMBRA INTRODUCCIÓN: La finalidad del aislamiento en cultivo, es conseguir el desarrollo de los microorganismos en colonias separadas para que en este estado de pureza se puedan estudiar los caracteres culturales de cada especie. La micología es la ciencia que trata el estudio de los hongos. Los hongos son organismos inmóviles que tienen la propiedad de formar filamentos o micelios. Se hallan ampliamente distribuidos en la naturaleza, en el suelo, agua, tierra, aire, vegetales, animales etc. la mayoría viven como saprofitos, la minoría parasitando organismos vegetales o animales. Muchas formas saprofitas se usan para la producción industrial de productos orgánicos complejos mediante los procesos de fermentación alcohólica. IDENTIFICACION DE HONGOS 1. Reconocimiento por cultivo 2. Inoculaciones RECONOCIMIENTO POR CULTIVO: La mayoría de los hongos se cultiva en medios como agar Saboraud, a 37ºC, o a temperaturas ambientes y en la oscuridad. Los hongos filamentosos se cultivan en agar Saboraud y a temperatura ambiente. Los hongos levaduriforme se cultivan en agar Saboraud y a 37ºC. OBJETIVOS: El estudiante procederá a realizar aislamiento en cultivo de una muestra problema, correlacionando la colonia con el hallazgo de la coloración de gram y coloración azul de lactofenol MATERIALES: -

Placas con agar Saboraud Frutas malogradas Asa de kolle en escuadra Mechero Microscopio Láminas laminillas

PROCEDIMIENTO: Hongos filamentosos Coger con el asa de siembra en escuadra una pequeña cantidad de muestra del hongo que se encuentra en frutas y ponerlo en la superficie del agar sin hacer ningún tipo de aislamiento, sólo puntos, rotular y ponerlos a temperatura ambiente, esperar a que se desarrolle de cinco a siete días, para su posterior identificación. Se colorea con azul de lactofenol.

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Levaduras: De las muestras de chicha de jora, frutas y otro material poner un inóculo en la superficie del agar y luego con el asa de siembra en “aro”, hacer aislamientos en zigzag para que puedan desarrollarse colonias separadas y poder estudiar sus características morfológicas. Las levaduras se colorean con la coloración de Gram y son Gram positivas HACER ESQUEMA:

Siembra Hongo Filamentoso

Siembra Hongo Levaduriforme

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PRÁCTICA N° 11 MÉTODO MICOLÓGICO II: Identificación de Mohos y levaduras. Los hongos son microorganismos ampliamente distribuidos en la naturaleza, en el suelo, sobre vegetales en el agua, en fruta, alimentos, animales y aire etc. Muchos son benéficos se utiliza en la industria, en la elaboración de antibióticos, producción de pan y en fermentación de bebidas alcohólicas. La minoría de hongos son ( hongos oportunistas) contaminan los alimentos, invaden cultivos de plantas produciendo aflatoxinas, producen micosis en el hombre y animales que puede ser micosis superficiales que afectan pelo, uñas y pies.. RECONOCIMIENTO POR CULTIVO: La mayoría de los hongos se cultiva en medios como agar Saboraud, a 37ºC, o a temperaturas ambientes y en la oscuridad. Los hongos filamentosos se cultivan en agar Saboraud y a temperatura ambiente. Los hongos levaduriformes se cultivan en agar Saboraud y a 37ºC. OBJETIVOS: El estudiante procederá a realizar aislamiento en cultivo de una muestra problema, correlacionando la colonia con el hallazgo de la coloración de Gram y coloración azul de lactofenol. MATERIALES: Placas con agar Saboraud con cultivo de hongos Asa de kolle en escuadra Mechero Microscopio Láminas laminillas Coplorante azul de lactofenol. Coloración de Gram PROCEDIMIENTO: Realizar la coloración con Azul de lactofenol para hongos filamentosos. Las levaduras se colorean con la coloración de Gram y son Gram positivas.

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PRACTICA Nº 10, 11

LABORATORIO DE HONGOS

HONGOS FILAMENTOSOS PENICILLIUM NOTATUM

Coloración Azul de Lactofenol 40 X

ASPEGILLUS NIGER

Coloración Azul de Lactofenol 40

X

RHIZOPUS S.P.

Coloración Azul de Lactofenol 40 X

CANDIDA ALBICANS

Coloración de Gram

100 X

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PRÁCTICA N° 12 PREPARACIÓN DE BEBIDAS ALCOHOLICAS INTRODUCCIÓN Las bebidas alcohólicas fermentadas se producen a partir de diversos productos vegetales que contienen hidratos de carbono adecuados. Cuando los hidratos de carbono se hacen disponibles en sus formas fermentables, la fermentación puede comenzar inmediatamente. La producción del vino o ciencia de la enología ( del griego oinos, vino logía, la ciencia del ) comienza con la recogida de la uva, continua con su prensado y la separación del líquido ( mosto) y finaliza con una serie de etapas de almacenamiento y envejecimiento. Todas las uvas producen mostos blancos. Para elaborar un vino tinto con uvas rojas, se deja que la piel u hollejo de las uvas permanezcan en o con el mosto antes de la fermentación para que liberen los componentes responsables del color de la piel. pueden elaborarse vinos utilizando los microorganismos naturales de la piel de las uvas, esta mezcla natural de bacterias y levaduras tiene unos resultados de fermentación imprevisibles. Para evitar este problema, se puede tratar el mosto fresco con un fumigante, normalmente dióxido de azufre, y añadir la cepa deseada de Saccharomyces cerevisiae o de S. ellipsoideus. Tras la inoculación el mosto se fermenta durante 3 a 5 días a temperaturas que oscilan entre los 20 y 28°C. El producto final puede contener entre un 10y 18% de alcohol PARTES DE LA UVA INVOLUCRADAS EN EL PROCESO. Pulpa: Constituye alrededor del 85 % del peso del grano, es un tejido frágil, el cual al romperse proporciona el mosto. Esta compuesto por células de varios tamaños con paredes celulares excesivamente delgadas, en ella se encuentra el azúcar que es almacenado en la uva en forma de glucosa (dextrosa), y fructosa (levulosa), en proporciones casi iguales, contiene aproximadamente 75 % de agua, ácidos tartáricos, ácidos málicos, ácidos cítricos y otros en menor cantidad. La pulpa contiene minerales y sustancias nitrogenadas tales como: fosfato, cloruros, sulfatos, calcio, potasio, hierro, proteínas, péptidos y aminoácidos libres que sirven como factores de crecimiento para las levaduras durante la fermentación. Semilla: el grano puede tener hasta cuatro o presentar ausencia total de semillas. Constituye hasta el 3 % del peso del grano, contiene gran cantidad de agua y materiales leñosos. Tiene de 8 % a 10 % de aceite, el cual no tiene importancia desde el punto de vista enológico y no se corre el riesgo que entre en o con el mosto pues la semilla al no romperse no los libera. También se encuentran en la semilla ácidos, minerales, y taninos, junto a los del hollejo le proporcionan la astringencia a los vinos tintos. OBJETIVO Elaboración de vino casero

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MATERIALES Para obtener aproximadamente 15 litros de vino: - 4½ Kg uvapasa - 1 cucharadita de azúcar - 1 cucharadita de levadura de panificaciión (granulada) - Gelatina natural en polvo sin sabor - Botellón de vidrio de aproximadamente 5 litros (u otro recipiente de boca angosta) - Cubeta grande o tina de unos 25 litros de capacidad - 2 metros de manguera de aproximadamentee 1½ cm de diámetro - Tapón de algodón y gasa para el recipieente - Coladera o tamiz - Lienzo muy limpio de 1 x 1 metro - 4 Botellas tapa de rosca PROCEDIMIENTO 1. Preparación de la pulpa • Selección Se recolecta o compra la fruta. • Pesado con cáscara • Pelado Se pela la fruta y se pesa nuevamente. No deben usarse ni las cáscaras ni las pepas. • Pesado sin cáscara Se recomienda pesar la fruta antes y después del pelado. • Licuado o Prensado Se troza y se licua la fruta pelada con agua hervida fría o se prensa manualmente, así se obtiene el mosto. 2. Acondicionamiento y corrección del mosto En este proceso se mide la pulpa obtenida y se echa sobre los tachos de fermentación. Luego se le añaden los insumos necesarios para corregir el mosto que consiste en controlar el azúcar y la acidez. Se inicia con la dilución de la pulpa en agua hervida fría, que disminuye la concentración de azúcar. 3. La fermentación alcohólica Para este paso se usa levadura liofilizada, previamente activada. Luego se añade al mosto y se deja en reposo por veinte días. 4. Descube y clarificado del vino Transcurridos los días de fermentación se procede al descube, que consiste en separar el vino de fruta de los residuos de levadura y sólidos precipitados al fondo del recipiente. 5. Embotellado Se lavan las botellas, debidamente seleccionadas.

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Elaboración de Vinos

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PRACTICA N° 12 REACCIÓN ANTÍGENO ANTICUERPO - PRODUCCIÒN DE ANTIBIOTICOS INTRODUCCION ANTÍGENO Se define como cualquier sustancia capaz de unirse específicamente a un anticuerpo o a un receptor de la célula T. Ahora se sabe que cualquier clase de molécula biológica incluyendo metabolitos intermediarios, azúcares, lípidos, hormonas, así como macromoléculas como hidratos de carbono como fosfolípidos, ácidos nucleicos y proteinas pueden servir de antígenos. Sin embargo sólo las macromoléculas pueden inciar la activación linfocitaria. ANTICUERPOS Los anticuerpos o inmunoglobulinas, son moléculas de proteinas capaces de combinarse con determinantes antigénicos. Se hallan presentes en el suero y líquidos corporales como las secreciones gástricas y la leche. Las inmunoglobulinas (Igs) se dividen en IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. REACCIONES ANTÍGENO – ANTICUERPO El estudio de las reacciones antígeno anticuerpo invitro se denomina serología. La reacción antígena anticuerpo, es una reacción específica, en la cual un antígeno que es corpuscular (no soluble) se une a unas moléculas de anticuerpos (Inmunoglobulinas) a través de sus determinantes antigénicos (epitopes). La unión del antígeno con el anticuerpo va a fomar un conglomerado que se visualiza a simple vista. Determinación de grupos sanguíneos (sistema ABO) y del factor (Rh) y la determinación de la presencia o no de anticuerpos contra Salmonella typhi en una muestra de suero problema, reacción de Widal. AGLUTINACION Cuando un antígeno no esta en solución, sino que se halla en la superficie de una célula u otra particula, la reacción antígena anticuerpo conlleva una agregación de las partículas que se denominan aglutinación. La aglutinación de los eritrocitos se denomina hemaglutinación. Las personas con gruposanguíneo tipo A tienen anticuerpos frente a los antígenos del grupo , mientras que los individuos del tipo O tienen anticuerpos anti A y anti B. GRUPO SANGUINEO ABO, en la superficie del eritrocito se encuentran los antígenos del grupo ABO. Existen cuatro combinaciones de los antígenos: A, B, AB y O, El plasma tiene anticuerpos contra los antígenos ausentes. Es importante para la determinación de grupos sanguíneos y las transfusiones sanguíneas.

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FACTOR Rh Proviene de Rhesus, genero de monos enque se descubrió. La mayoría de personas tienen antígeno D y otros antígenos Rh y son Rh positivos y el resto carecen de este antígeno y son Rh negativos. Es importante en la enfermedad hemolítica del recién nacido, eristoblastocis fetal REACCION DE WIDAL (aglutinación en lámina) Es una reacción antígeno anticuerpo. Los anticuerpos aumentan significativamente, durante la segunda y tercera semana de la infección. El método consiste en hacer reaccionar el suero del paciente contra antígenos conocidos de S.typhi, S.paratyphi A y S. paratyphi B. GRUPO SANGUINEO Y Rh MATERIAL:

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Láminas de vidrio Mondadientes Suero Anti A, color azul Suero Anti B, color amarillo

Suero Anti D (Rh), incoloro Lancetas estériles Algodón y alcohol

PROCEDIMIENTO Limpiar el pulpejo de un dedo Punzar con la lanceta y colocar tres gotas de sangre en un portaobjetos Añadir el antisuero anti A, a una de las gotas de sangre, el anti B a la siguiente gota y por último el anti Rh a la última gota. Con un mondadientes mezclar cada una de las gotas de sangre, rotar la lámina con movimientos suaves Observar cuales aglutinan Hacer esquema Grupo Sanguíneo ABO

Anti A

Tipo Sanguíneo Rh

Anti B

Anti Rh

REACCIÓN DE WIDAL MATERIAL Láminas portaobjetos Mondadientes Pipetas serológicas Antígenos de Salmonella Typhi O , Salmonella Typhi H, Salmonella paratyphi A y Salmonella partyphi B. Mechero

PROCEDIMIENTO. - Con micropipeta colocar en cada pocillo o cuadrado de la lámina de aglutinación las cantidades de suero problema 40 uml 1/40

20 uml 1/80

10 uml 1/160

5 uml 1/320

- Añadir a cada pocillo una gota del antígeno conocido a investigar Mezclar con un palillo mondadientes

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Mover en rotación calentando suavemente Observar con luz y fondo oscuro la aparición de aglutinación LECTURA 4 + = grumos gruesos 1 + = grumos finos - = No hay aglutinación Cavidad

1

2

3

4

10 uml

5 uml

30 uml

30 uml

es Suero problema Antígeno 1 gota Título final Lectura

40 uml 30 uml

20 uml 30 uml

PREPARACIÓN DE ANTIBIOTICOS INTRODUCCIÓN Los antibióticos son sustancias que se usan para matar o inhibir el crecimiento de las bacterias. El antibiótico pionero fue la penicilina, que revolucionó el tratamiento de las infecciones, como la neumonía y la tuberculosis, y su producción, a partir de hongos, constituyó la primer aplicación de la biotecnología a la industria farmacéutica. Su descubrimiento se debe a Alexander Fleming, que en 1928 encontró que el hongo Penicillum notatum producía "algo" capaz de matar a las bacterias que estaba estudiando. En 1938 Howard Florey y Ernst Chain aislaron la penicilina a partir del hongo y realizaron los experimentos claves en ratones. La producción comercial comenzó en 1943. Actualmente, la mayoría de los antibióticos, denominados "naturales", se obtienen a partir

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de los microorganismos que los producen. Así, mientras algunas especies de Penicillum producen penicilina, otras fabrican antibióticos tan importantes como las cefalosporinas. Otros antibióticos naturales muy conocidos, como la tetraciclina, la estreptomicina y la eritromicina, son elaborados por bacterias del género Streptomyces. Los antibióticos denominados "semi-sintéticos" son extraídos de microbios y luego mejorados en el laboratorio. Tal es el caso de la ampicilina, que surge de la modificación química de la penicilina. Finalmente, algunos antibióticos, como las sulfamidas, son fabricados enteramente en el laboratorio y por eso son llamados "antibióticos sintéticos". Copyright ArgenBio 2007) Definición de antibiótico Antibiótico (del griego, anti, ‘contra’; bios, ‘vida’), cualquier compuesto químico utilizado para eliminar o inhibir el crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad común a todos los antibióticos es la toxicidad selectiva: la toxicidad es superior para los organismos invasores que para los animales o los seres humanos que los hospedan. La penicilina es el antibiótico más conocido, y ha sido empleado para tratar múltiples enfermedades infecciosas, como la sífilis, la gonorrea, el tétanos o la escarlatina. La estreptomicina es otro antibiótico que se usa en el tratamiento de la tuberculosis. En un principio, el término antibiótico sólo se utilizaba para referirse a los compuestos orgánicos producidos por bacterias u hongos que resultaban tóxicos para otros microorganismos. En la actualidad también se emplea para denominar compuestos sintéticos o semisintéticos. Los antibacterianos son la principal categoría de antibióticos, pero se incluye también en este tipo de fármacos a los antipalúdicos, antivirales y antiprotozoos. MÉTODOS DE PRODUCCIÓN OBTENCIÓN DE PENICILINA POR FERMENTACIÓN SUMERGIDA. El inoculum o "simiente" para las grandes cubas de fermentación de 20.000 a 115.000 litros de capacidad se prepara por el desarrollo de un cultivo madre del hongo a partir de esporas liofilizadas que se encuentran en un sustrato de agar nutritivo. Varios litros del medio de cultivo, generalmente constituyendo del 5 al 10 % del contenido total, se preparan en una serie de depósitos de siembra y servirán para sembrar una gran cuba de fermentación. Las cuatro fases principales de la fabricación de la penicilina son:  Fermentación  Separación del micelio del caldo fermentado y extracción de la penicilina por medio de disolventes.  Purificación con disolventes y formación de la sal sodica de la penicilina.  Ensayos de control, almacenamiento y venta. El caldo de cultivo para la fermentación se obtiene por infusión acuosa de maíz, añadiendo de un 2 a un 3 % de lactosa, y también se adicionan compuestos inorgánicos conteniendo hidrogeno, oxigeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio, nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc. La adición de ciertos compuestos que favorecen el crecimiento del hongo debe evitarse, ya que podrían ser tolerados al istrar el producto, ni su eliminación seria económica. Después de ajustar el pH a 4,5-5,0, el medio de cultivo se pasa al fermentador, que esta equipado con un agitador vertical, con un sistema de introducción de aire esterilizado por filtración y con serpentines para mantener la temperatura deseada. El hongo se introduce por medio de conducciones estériles y con ayuda de aire a presión. Durante el crecimiento el medio se esteriliza con vapor a presión, y la temperatura se mantiene entre 23 y 25 ºC. El aire estéril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitación facilita su uniforme distribución en el seno del liquido. Se requiere un volumen de aire por minuto y por volumen de medio de cultivo. El proceso se

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controla intervalos que oscilan entre 3 y 6 horas; al cabo de unas 50 a 90 horas el crecimiento se va haciendo mas lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por completo. La masa se enfría a 5 ºC. a causa de la inestabilidad de la penicilina a la temperatura ambiente, y se separa el micelio en un filtro de tambor rotatorio. En el procedimiento antiguo, la penicilina se extraía del filtrado por adsorción sobre carbón vegetal. Se eluía con acetato de amilo, una vez concentrado el eluido se enfriaba a 0 ºC y se acidificaba hasta pH 2,0 con un ácido orgánico. En el proceso de extracción por disolvente, se omite el paso de adsorción con carbón activo y el liquido filtrado (llamado "beer") se ajusta a pH 2,5 con ácido fosfórico en la misma conducción. Se efectúa una extracción continua a contracorriente con acetato de amilo y luego con cloroformo, concentrándose en sucesivos extractores centrífugos tipo Podbielniak, y el liquido final se trata con tampón de fosfato y bicarbonato sódico para formar la sal sódica. Este producto se esteriliza por filtración y se elimina asépticamente98 del agua y demás disolventes por cristalización, con lo cual se obtiene penicilina cristalina, que una vez seca puede envasarse en bolsas de politeno, o en recipientes de vidrio o de acero inoxidable. Las penicilinas  Estructura Química y Mecanismo de Acción de la penicilina: Estructura Química La estructura básica de la penicilina (ácido 6-aminopenicilanico) consiste en un anillo de tiazolidina unido a un anillo betalactámico y una cadena lateral (que está compuesta por un grupo amino secundario).

Mecanismo de Acción El mecanismo de acción de las penicilinas no ha sido completamente dilucidado. Sin embargo se sabe que ellas actúan mediante la inhibición en la síntesis de la pared celular de la bacteria y la activación de su sistema autolítico (autolisinas). La acción de las penicilinas necesita la presencia de una pared celular que contenga peptidoglicanos. En la división activa de la bacteria, las penicilinas inhiben ciertas enzimas que crean reacción cruzada entre las cadenas peptídicas de la pared y de esta forma impiden el desarrollo de la estructura normal del peptidoglicano. Mediante este mecanismo se crea una pared celular defectuosa que no protege a la baceria y fácilmente se produce la lísis celular del microorganismo por la alta presión osmótica de su interior. OBJETIVOS

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

Producción de penicilina por el hongo Penicillium notatun

MATERIALES  Portaobjetos  Asa microbiologica  Microscopio  Medios de cultivo (Agar Sabouraud, caldo saboraud, agar triptosa, glucosa)  Mechero  Placas Petri  Frascos  Autoclave  Azul de Lactofenol  Disco de penicilina  Pipeta Pasteur  Micropipeta  Estufa Material biològico   

Muestras de hongos obtenidas de frutas (naranja, lima y mandarina). Microorganismos indicadores (bacterias Stafilococcus aureus, ).

PROCESO FERMENTATIVO: 1- Fermentación sumergida en tanques de 40000 a 200000L 2- Velocidad de aireación: 0.5-1.0 vvm 3- Agitación: impulsores tipo turbina (120-150 rpm) 4- Temperatura óptima: 25-27ºC 5- pH: 6.5 PROCEDIMIENTO Obtención de la penicilina Luego de comprobar la presencia del hongo se procede a sembrar en medios líquidos (Caldo sabouraud y caldo de glucosa) para la obtención del antibiótico natural. Se procede a sembrar en los medios líquidos, frascos con 90 ml de caldo saboraud, caldo glucosa, el hongo de la placa con agar saboraud y se deja a temperatura ambiente (25300C) durante 7 a 10 días. Los medios de cultivo líquidos se agitarán en un agitador mecánico o en forma manual durante estos días para lograr una buena aireación. Comprobación de la existencia del antibiótico en el medio

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Por medio de un antibiograma bacterias sensibles a la penicilina comercial. La forma para la comprobación de la presencia de penicilina es la siguiente: Sobre un medio de agar triptosa se realizan hoyos con la ayuda de una pipeta pasteur estéril, posteriormente se siembra la bacteria sensible sobre toda la placa, con la ayuda de un hisopo hasta agotar la muestra. Luego con una micropipeta se llenan los hoyos anteriormente hechos con los medios liquidos (caldo sabouraud y caldo de glucosa). Se deja en la estufa hasta la formación del halo indicador de la sensibilidad. RESULTADOS Se procedió a hacer varios ensayos para la comprobación de la fabricación de la penicilina. HALO DE SENSIBILIDAD mm Bacteria 1 Bacteria 2 X = presencia de halo.

Caldo Sabouraud

Caldo de glucosa

-

x -

REALICE ESQUEMAS, DIBUJOS, FOTOS, ETC

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PRÁCTICA N° 13 MICROBIOLOGÍA DE PRODUCTOS LACTEOS PRODUCCIÓN DE YOGURT INTRODUCCIÓN En todos los alimentos frescos están presentes algunos microorganismos viables. La finalidad de los métodos de valoración es detectar evidencia de un crecimiento microbiano anormal en los alimentos o detectar la presencia de organismos específicos de importancia sanitaria, tales como Salmonella, Staphylococcus y Clostridium botulinum. Staphylococcus son de la familia Micrococaceae, son cocos Gram Positivos. Hay dos especies importantes, Staphylococcus aureus, produce un pigmento dorado, en agar

100

sangre da hemólisis y coagula al plasma sanguineo. Causa abcesos, forunculosis, síndrome de intoxicación alimentaria, su presencia en los alimentos es totalmente inaceptable. Staphylococcus epidermidis no produce coagulasa ni pigmento. OBJETIVO Identificar microorganismos causantes de infecciones alimentarias. MATERIAL : Placas Petri Tubo de ensayo Matraz Medios de cultivo Estufas Mechero Bunsem Cocina eléctrica

Estufa Baño María 44ºC Termómetro Pipetas Coloración de Gram Lámina Microscopio

PROCEDIMIENTO NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS Preparar las diluciones de la muestra. Pesar 10 grs de muestra y transferirlos a un frasco con 90 ml de diluyente. Luego licuarlos si el alimento es sólido. Pipetear 1 ml de la dilución 10-1 a un tubo que contiene 9 ml de diluyente obteniéndose la dilución 10-2 Repetir este proceso para preparar las diluciones 10 -3, 10-4, 10-5 . Luego de cada dilución transferir 1 ml a cada una de las placas petri, agregarle Agar recuento a 44º C. NUMERACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVO Preparar la muestra de alimento. Pipetear a placas petri estériles, alicuotas de 1 ml a partir de las diluciones 10 – 1 , 10 – 2 , 10 –3 Adicionar 15 a 20 ml de agar Chapman a 44º C a las placas petri que contienen la muestra, tapar y mezclar en forma suave mediante movimientos de vaiven y de rotación. Dejar solidificar, incubar las placas en posición invertida a 35 – 37 ºC por 36 horas. Numeración de Bacterias Coliformes Totales Por el Método del Número Mas Probable (NMP) Prueba Presuntiva. Disponer 9 tubos de ensayo estériles con campana Durham y que contengan caldo Lauril. Pipetear 10 ml. de la muestra de agua a cada tubo de los tres primeros tripletes. Pipetear 1 ml de la muestra de agua a los tres tubos de los segundos tripletes. Pipetear 0.1 a los tres últimos tripletes. (utilizar 3 tubos por cada dilución). Agitar y evitar que se forme burbujas de aire. Despues de 24 hrs. de incubación, anotar los tubos que muestren producción de gas en las campanas de Durham. Reincubar los tubos 24 hrs más. Pasadas las 48 hrs. anotar los tubos que presenten gas. Seleccionar los tubos que presenten acidez y gas, para la determinación del NMP, y para la prueba confirmativa. Contar el número de tubos positivos obtenidos en cada subgrupo. Ejm. Primera dilución 3, segunda dilución 2, tercera dilución 1. (3-2-1). Ubicar en la tabla en NMP la triada 3-2-1 que corresponde a 150 NMP por gramo o ml. Prueba Confirmativa

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De los tubos positivos coger una asada y cultivar en agar EMB por 24 hrs. a 37ºC. Si la placa muestra colonias verdes con brillo metálico, pasar a tubos de TSI, LIA, indol. Anotar los resultados y hacer esquemas. REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO Se determina la frescura de la leche, cuanto más vieja, contiene mayor cantidad de gérmenes, es decir es buena cuando contiene pocos gérmenes, es mala cuando tiene muchos gérmenes y además se acidifica. La enzima responsable de la decoloración del azul de metileno es la Xantino oxidasa o Xantino dehidrasa tambien llamada enzima Schardinger. La enzima es una deshidrogenasa. Estrructuralmente se trata de una flavoproteina rica en Hierro y Molibdeno. El método de reducción del azul de metileno, mide en términos de intervalo de tiempo requerido, la decoloración de una mezcla colorante-leche de color azul, hasta el blanco, desde el comienzo de la incubación. El de tiempo de reducción es inversamente proporcional al contenido bacteriano de la muestra de leche, contando desde el inicio de la reducción. RESULTADO NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS VIABLES Dil 10 - 1

Dil 10 –2

Dil 10 –3

NUMERACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVO Dil 10 - 1

Dil 10 –2

Dil 10 –3

NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES, DETERMINACIÓN DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP/100 gr) PRUEBA PRESUNTIVA Dil 10-1

MUESTRA

Dil 10-2

Dil 10-3

NMP

PRUEBA CONFIRMATIVA Muestra Aislamiento e Identificación Pruebas Bioquímicas. ESQUEMA DE TRABAJO PRACTICA Nº 10 ANALISIS BACTERIOLOGICO DE ALIMENTOS: Leche fresca, helados, etc10 ml.

1 ml

90 ml A.P.

1 ml

9 ml. A.P.

102

MUESTRA

Dil 10-1

Dil 10 –2

Dil 10 –3

1 ml

1 ml

1 ml

Numeración microorganismos Aerobios mesófilos AGAR RECUENTO 44ºC 1 ml

1 ml

1 ml Numeración Staphylococcus aureus coagulasa

AGAR CHAPMAN 44ºC 1 ml c/u

1 ml c /u

1 ml c /u

NUMERACION COLIFORMES 10-1

10-2 C LVBB

10-3

PRUEBA DE LA REDUCTASA. Leche entera (fresca)

+ 1 ml Sol. Azul Metileno 10 ml

10 ml

Colocar los tubos en baño de agua hirviendo por 3 min. (Para destruir la acción reductora de leche

Mezclar Invirtiendo 2 veces

+ 1 ml agua destilada

muestra

10 ml + 1 ml Sol. Azul Metileno

INTERPRETACION DE LA PRUEBA DE LA REDUCTASA

Durante la incubación se observan cambios de color, lo que expresa el tiempo transcurrido desde el inicio de la incubación hasta la decoloración completa. El tiempo de reducción se expresa en horas y medias horas transcurridas desde el inicio de la incubación hasta la completa decoloración. Bajo ninguna circunstancia se reportan los resultados en términos de números de bacterias. TABLA DE CALIFICACIÓN DE LA LECHE CRUDA Calidad de la leche Muy buena Buena

Tiempo de reducción De 6 hr. a más De 4 a 5,40 hrs

Recuento en placas Hasta 200 000 De 200 mil a 700 mil

Conservación Más de 32 horas De 22 a 32 hrs.

103

Mala Muy Mala

De 2 a 3,30 hrs. De 0,5 a 1 hr.

De 700 mil a 5 millones 5 millones o más

De 14 a más hr. De 15 a 22 hrs.

PRODUCCIÓN DE YOGURT INTRODUCCIÓN El yogurt es un producto lácteo fermentado, levemente ácido, de cultivo semisólido que es producido por homogeneización y pasteurización. El yogurt, es un producto efectivo para restaurar y mantener el funcionamiento normal de nuestro equilibrio intestinal, rico en vitaminas B. Este producto tiene una gran variedad de sabores, y es barato. El yogurt se ha popularizado en muchos países al rededor del mundo. Mucha gente con problemas digestivos consume yogurt para ayudar al tratamiento de este desorden. Otros lo consumen para mantener o conservar su salud ya que proporciona nutrientes. Además, el yogurt es producido a bajo costo lo que es un beneficio para los consumidores y productores. Por supuesto, los muchos beneficios del yogurt son, de poca importancia para muchos consumidores, ya que ellos lo consumen por su agradable sabor.

104

El yogurt tuvo sus orígenes en Turquía. Los procedimientos usados para la producción en masa fueron desarrollados en naciones occidentales. La importancia de la planta descrita en este estudio no sólo es el bajo costo para instalarla, sino también para operarla. Ambas en conjunto con el crecimiento de la popularidad internacional del yogurt, hace de este estudio una inversión razonable para cualquier emprendedor que desee establecer una producción capaz de generar un rápido retorno de la inversión, así como también un flujo estable de ganancias para los años siguientes. Nutricionalmente: varia en funcion del contenido de grasa y adulcorantes, sin embargo por las caracteristica de los cultivos se les encuentra dentro de los denominados probioticos, buen contenido de proteinas, ademas: 1.Estimula las secreciones del aparato digestivo. 2.Da buena digestibilidad y aumenta el coeficiente de retención de numerosas sustancias. 3. Alimento importante para personas intolerantes a la lactosa ( por tener deficiencia de la enzima lactasa ( enzima que hidroliza la lactosa). OBJETIVO 

Conocer el proceso de elaboración de un yogurt a nivel de planta piloto.



Identificar las variables de proceso más incidentes en las propiedades organolépticas del producto final.



Identificar los efectos de la utilización de determinado cultivo en el proceso de elaboración de yogurt

MATERIALES Leche fresca, leche evaporada Agua hervida estéril Cepas de bacterias de lactobacillus Estufa

Cepas de Streptococcus lactis Matraces estériles vasos de plástico Frasco de yogurt

PROCEDIMIENTO 1. Calentar la leche a 60°c (grados centigrados) (puede ser la sacada de la vaca directamente mas llamada 'de cantina' o la pasteurizada) 2. Añadir 100 gramos de Azúcar por cada litro de leche 3. Hervir la leche (en lenguaje técnico 'pasteurizar') a 85 grados centigrados por 30 minutos (bajar el fuego cuando comience a hervir) 4. Despues de estar 30 minutos a 85 grados, bajarlo a 45 °c y añadir cultivo, este puede ser 5 cucharadas de yogurt por cada 2 litros (el yogurt es el que venden en vaso en la tienda), o un cultivo especial que venden en la tienda de insumos lácteos. 5. Vertir esta leche con cultivo en una vasija de vidrio limpia, mantener esta temperatura por 3 a 6 horas , si pasa de este tiempo queda kumis, por favor sean cuidadosos en el

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tiempo, esto se llama tiempo de encubacion. se pude mantener la temperatura metiéndolo en caja de tecnopor o arropándolo con cobijas o mantas de dormir y dejándolo en un lugar tibio, dejarlo 4 horas. 6. Despues del tiempo de encubación se mira si el yogur cuajó o no, si cuajó se lleva a la nevera por 10 horas ,si no se pasa a una olla y se calienta a baño maria( una vasija dentro de otra, la esta en el fogón con agua caliente)hasta que el yogurt alcance 45°c ,pasar nuevamente al envase de vidrio y encubar nuevamente de 3 a 6 horas ,cuando cuaje, se bate suavemente en un solo sentido. 7. Se lleva a la nevera hasta el otro dia. Por la mañana ya tendrás un delicioso yogurt. Tratamiento térmico. 



Para todos los productos lácteos el principal objetivo de los tratamientos térmicos consiste en destruir las bacterias patógenas y bacterias que afectan la conservación de la leche. En la elaboración de productos fermentados se usa normalmente un tratamiento térmico más fuerte que en una pasteurización fosfatasa negativa. Las temperaturas y tiempo de retención varían entre 80°C y 95°C por 30-20 minutos. Con este tratamiento térmico se consigue aumentar la viscosidad del producto y un mejor medio para el cultivo. A estas altas temperaturas las proteínas del suero se desnaturalizan, absorbiendo agua y se asocian a las caseínas.



Inoculación del cultivo iniciador



El cultivo iniciador se puede encontrar de distintas formas; congelado, liofilizado, liquido. Los cultivos iniciadores mas ampliamente utilizados en Norte América es una mezcla simbiótica de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (ST) y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (LB), conocida como probióticos, pueden crecer independientemente, el grado de producción de ácido láctico es mucho mas alto cuando se utilizan ambos que cuando se utilizan individualmente. El ST crece mas rápido y produce acido y dióxido de carbono. El formato y dióxido de carbono producido estimula el crecimiento del LB. De otro lado la actividad proteolítica del LB produce péptido y aminoácidos que estimulan el crecimiento del ST. Estos microorganismos son los responsables finalmente de la formación aroma y textura típicos del yogur. Durante la fermentación la mezcla de yogur coagula produciendo un descenso del pH. El Streptococcus es responsable de la caída inicial del pH hasta aproximadamente 5.0. Entre tanto el Lactobacillus es el responsable del descenso del pH hasta 4.0.



Incubación.



Si la leche esta libre de inhibidores, la actividad de microorganismos esta determinada principalmente por la temperatura de incubación y la cantidad de inóculo agregado. Mientras mayor sea la diferencia con la temperatura óptima y menor sea la cantidad de inóculo agregado mayor será el tiempo de fermentación.



La fermentación del yogurt es el resultado de la actuación de dos fermentos lácticos: la actobacillus bulgaricus y streptococcus thermophilus. El lactobacillus

106

bulgaricus es una bacteria láctica homofermentativa que se desarrolla óptimamente entre 45 y 50oC, acidificando fuertemente el medio. Puede formar hasta un 2,7 % de ácido láctico en la leche. El streptococcus thermophilus se multiplica bien entre 37 y 40oC, pero también se desarrolla a 50oC. Es una especie homofermentativa termorresistente, que sobrevive un calentamiento a 65 oC durante 30 minutos. Es mucho menos acidificante que la especie procedente. Puede ser destruida por un fago termorresistente. Ambos gérmenes son microaerofilos y soportan muy bien los medios ácidos (pH 4 a 4,5). En el yogurt conviven en estrecha simbiosis. En efecto, cuando se cultivan conjuntamente, producen mas ácido láctico que cuando crecen aislados. El lactobacillus, proteolitico, obtiene ciertos aminoácidos de la caseina, los cuales activan el desarrollo de los estreptococos. Una de los más importantes es la valina. 

Al comienzo de la preparación, el pH de la leche es favorable a los estreptococos estos predominan y ponen en marcha la fermentación láctica. La acción caseolitica de los lactobacilos estimula el desarrollo de los estreptococos. En cualquier caso, al prolongar la acidificación, el pH de la leche se vuelve poco favorable para los estreptococos, que progresivamente son rechazados por los lactobacilos. En 1968, se demostró que streptococcus thermophilus también estimula el crecimiento del lactobacilo produciendo un metabolito que puede ser reemplazado por el ácido fórmico.



La coagulación se produce a causa de la estabilidad de las caseínas. En la leche fresca con pH alrededor de 6.7 las caseínas tienen cargas negativas y se repelen entre si. En la acidificación de la leche los iones hidrógeno positivos del ácido son absorbidos por las caseínas, por lo que la carga negativa va disminuyendo y así también la repulsión entre ellas. La coagulación empieza cuando la repulsión ha disminuido. A un pH de 4.6 (punto isoeléctrico de la caseína) las caseínas son eléctricamente neutras y completamente insolubles, ello se ve evidenciado por la formacion de un gel, con una evolución creciente de la viscocidad.



Ruptura y enfriamiento del coágulo.



La ruptura del coágulo se produce por agitación para conseguir una masa homogénea, brillante y viscosa. El enfriamiento se efectúa para detener la multiplicación microbiana y como consecuencia de esto el desarrollo de una mayor acidez.



Caracteristicas de aroma y sabor



El aroma característico del yoghourt fue atribuido al principio exclusivamente al desarrollo del estreptococo. Sin embargo se insistió recientemente en la importancia de los lactobacilos con respecto al aroma. Se descubrió que uno de los principales componentes del aroma del yoghourt es el acetaldehido, sin embargo contribuyen tambien: acido láctico, ácido acético y diacetilo



Envasado.

107

Se recomienda enfriar el producto a 22-24°C ya que a esa temperatura se inhibe el desarrollo de las bacterias. A esta temperatura eventualmente se adicionan las frutas y el azúcar, terminando con el envasado. El enfriamiento del producto da también una mejor estabilidad porque las proteínas absorben más agua a bajas temperaturas y por la reconstrucción de la estructura de las proteínas. Si se envasa a bajas temperaturas se destruye la estructura de las proteínas y no es posible conformarla otra vez a las temperaturas bajas de almacenamiento. 

Almacenamiento. Siempre debe efectuarse bajo refrigeración, como así mismo la distribución y venta, pues los cambios sucesivos de temperatura atentan contra la conservación del producto tanto desde el punto de vista microbiológico como físico (estabilidad). La cuarto de almacenamiento debe mantenerse limpia y aseada y no debe emplearse para otros productos que puedan causar mal sabor y olor.

 

Aditivos usados en la elaboración: ADITIVOS - Colorantes; Se permite la adición de colorantes naturales, autorizados por el Ministerio de Salud, Resolución No. 10593/85, Adicionados en la cantidad mínima indispensable para lograr el efecto deseado. Se permite la adición de colorantes artificiales autorizados por el Ministerio de Salud, Resolución No 10593 de 1985, en cantidad máximo de 30 mg/Kg.



- Saborizantes: Se permite la adición de saborlzantes naturales o artificiales autorizados por el Ministerio de Salud, adicionados en la cantidad mínima indispensable para lograr el efecto deseado.



En la leche fermentada larga vida, se permite además la adición de



- Estabilizantes : Carbonato de calcio, potasio y sodio , Cifrara de calcio, potasio y sodio,Ortofosfato de potasio y sodio, Polifosfato de potasio, sodio y calcio. Solos o en mezcla en una cantidad máxima de 10 g/kg



Gelificantes . Emulsificantes



Ácido algínico y sus sales de amonio, calcio, potasio y propilenglicol, Agar, Carboximetil celulosa de Sodio, Carragenina, Goma Guar , Goma Arábiga, Goma Karaya ,Goma Xantan, Gelatina, Pectina, Solos o en mezcla en una cantidad máxima de 5 g/kg



Los estabilizantes , como los sólidos lácteos tienen influencia positiva sobre la consistencia y estabilidad del yogur, en la práctica los más usados son: la gelatina, almidones, gomas vegetales y la pectina. La cantidad de estabilizante a usar depende de la consistencia deseada en el producto final, debiendo tener cuidado con la adición excesiva pues transmite sabores extraños al yogur (sabor a almidón, por ejemplo). Por regla general los estabilizantes son usados en rangos de 0.1 a 0.3% pero en el caso de la pectina se usa en niveles de 0.05% para yogur con frutas.

108

2.



El edulcorante más ampliamente utilizado es la sacarosa por su disponibilidad, buena solubilidad, alto poder endulzante y por la facilitad con que se puede manipular. Generalmente se usan cantidades entre 5 y 10%. Otros endulzantes utilizados son el sorbitol, xilitol, sacarina y sus sales sódicas y cálcicas y el aspartame.



La gama de frutas y saborizantes que actualmente existen es extremadamente amplia.



El uso de preservativos está limitado de acuerdo a la legislación y no debiera ser necesario con una pasteurización efectiva y una buena higiene durante el proceso INFORMACIÓN GENERAL DEL PROCESO.

2.1 DIAGRAMA DE FLUJO.

109

PREPARACIÓN DE QUESOS EL QUESO

110

El queso es un alimento sólido elaborado a partir de la leche cuajada de vaca, cabra, oveja, búfala, camella u otros mamíferos rumiantes. Es la conserva ideal pues muy difícilmente se estropea con el transcurso del tiempo ya que al secarse mejoran sus cualidades en relación al peso. La leche es inducida a cuajarse usando una combinación de cuajo (o algún sustituto) y acidificación. Las bacterias se encargan de acidificar la leche, jugando también un papel importante en la definición de la textura y el sabor de la mayoría de los quesos. Algunos también contienen mohos, tanto en la superficie exterior como en el interior. Para preparar un queso de regular tamaño, hay que usar bastante leche: por cada 10 litros de leche se obtiene 1 kilogramo de queso. PREPARACIÓN Para empezar, tome 10 litros de leche pasteurizada con 3% al 4 % de grasa y caliéntela a 65° o 70° C. Mediante este proceso eliminará la flora que puede causar daño. Si trabaja con leche pasteurizada no es necesario hervirla, porque perderá algunas características convenientes para elaborar quesos. Déjela enfriar a temperatura ambiente hasta que alcance 40° C. En ese momento añada a la leche un yogurt natural (sin sabor) de 250 ce. El yogurt posee una alta concentración de lactobacilus, encargados de desarrollar diferentes sabores en el queso. Agregue el cuajo. Este producto puede adquirirse en las farmacias botánicas, generalmente en forma de pastillas. Para 10 litros de leche, un cuarto de pastilla es suficiente. El cuajo es una enzima, que ayuda a coagular la proteína de la leche. Deje la mezcla a temperatura ambiente 1 ó 2 horas hasta que se haya solidificado por completo. Para saber si está a punto, mueva el recipiente: si observa que la leche se separa de las paredes en un solo bloque, es tiempo de seguir con el próximo paso. ¿Cómo cuajar? Durante esta etapa se define la "personalidad" del queso. Básicamente, la idea es cuajar (leche solidificada) y quitarle todo el agua posible. Para lograrlo, corte cubitos de 1 1/2 ó 2 plg. La técnica ideal consiste usar un cuchillo bien afilado y trazar una superficie cuadriculada sobre la masa, para obtener pequeños cubitos. Observará cómo el cuajo comienza a soltar una sustancia líquida o suero. Los cubitos comenzarán a hundirse y el líquido ascenderá. La idea es separar las partes sólidas y botar el agua. Si nota que algunas pequeñas partículas de queso flotan en el agua, use un colador para no perderlas. La leche cuajada se puede volver a cortar para eliminar más agua o bien hacer pequeños surcos sobre la misma para que actúen como un canal de drenaje. Una vez que extrajo todo el líquido posible, coloque los cubitos en recipientes pequeños de plástico. Los envases de mantequilla o queso crema son ideales pues, solo tendrá que agujerearlos previamente con un clavo caliente en la base y los laterales.

111

Llene cada recipiente hasta la mitad y coloque en la parte superior un cilindro a modo de tapa con peso encima para que la masa se prense y pierda el agua restante. No coloque trozos separados entre sí en un mismo recipiente, para evitar espacios de aire donde pueden desarrollarse procesos de fermentación. Deje reposar 24 horas a temperatura ambiente. Desmóldelo y colóquelo en la refrigeradora envuelto en plástico para microondas.

Diez pasos para no equivocarse al hacer queso casero 1. Calentar la leche pasteurizada entre 65 a 70 ° C. 2. Enfriar hasta que alcance los 40° C. 3. Añadir el cultivo lácteo (yogurt natural) y el cuajo. 4. Dejar reposar a temperatura ambiente de 1 a 2 horas. 5. Cortar la cuajada en cubitos y extraer la mayor cantidad de agua posible 6. Agregar sal. 7. Poner dentro de recipientes agujereados y prense. 8. Desmoldar. 9. Empacar con plástico para microondas. 10. Almacenar en la refrigeradora.

Trucos para cortar el queso casero

Haga cortes horizontales con un cuchillo.

2 Luego haga cortes verticales formando cuadrados.

112

3 Con el cuchillo inclinado haga cortes tranversales.

4 Separe los cubitos y bote el agua.

PROCESO Y FABRICACIÓN DE QUESOS (abordaje genérico) Recepción de la Materia prima. Recepción: Tarea en que la leche se higieniza con el fin de eliminar las impurezas provenientes del tambo, esta operación se realiza con un tanque en acero inox. de recepción, equipado con coladores muy finos. Homogenización de la leche. se homogeniza si se quiere tenga parámetros específicos de materia grasa, para ello se utilizan desnatadoras que por acción centrífuga separan la grasa láctea. En el caso de no realizar el tratamiento de homogenización, el queso se fabrica con leche entera. Almacenamiento: Posteriormente, si la leche no será sometida al proceso de fabricación en ese mismo momento, se enfría a 3-4º, que es la temperatura óptima de conservación incluida su transporte. Pasteurización: Tratamientos térmicos de la leche. Antes de iniciar la fabricación del queso, con leche recién ordeñada, o con leche refrigerada, almacenada, la leche se puede someter a un proceso térmico a 70/80º durante 20/40 segundos, a este proceso se le denomina pasterización, realizada con equipos pasteurizadores de control de temperatura, su objetivo es eliminar 113

microbios patógenos de la leche. Cuando este proceso no se aplica se dice que el queso está fabricado con leche cruda. El queso fabricado con leche cruda, es sabrosísimo, y se le puede consumir sin ningún problema, siempre que tengan más de 60 días de curación, o bien con una maduración inferior si la leche procede de tambos higienizados y con buenas prácticas de producción, Tanqueado: Llenado del Tanque/cuba y adición de fermentos Una vez leche tratada térmicamente, o cruda, esta se vierte en un tanque/cuba, llevándose a cabo un proceso de calentamiento hasta 25-30º de temperatura, en la que se añaden los cultivos de bacterias lácticas, y fermentos, mohos cuya misión es que crezcan y aporten aromas y sabores a desarrollarse en todo el proceso de la maduración Coagulación de la Leche En acto seguido, se añade el Cuajo en las proporciones indicadas por el fabricante y dependiendo el tipo de queso, es en este momento cuando la leche pasa a transformarse en queso, puesto que la caseína (la más importante proteína de la leche) es coagulada a unos 30/32º, las formulaciones para la fabricación conforme el queso van entre los 30º/35º Otra técnica de coagulación es mediante la acidificación de la leche, ésta se deja a temperatura ambiente y su acidez va subiendo hasta que adquiere un aspecto de cuajada ó de “leche cortada”. este sistema es utilizado para la fabricación de varios tipos de quesos. Corte de la masa Cuajada Cuando la coagulación ha terminado, convertida en masa cuajada, se procede a cortarla mediante cuchillas o liras, el objeto de cortar la masa es conseguir con granos/cuadritos de mayor o menor tamaño dependiendo del suero que se quiera retener, normalmente un queso más húmedo (quesos frescos) está formado por granos más grandes, Es en esta fase cuando se extrae el suero sobrante (suero es la parte líquida de la leche que no ha sido aprovechada en la fabricación del queso) la cual entre otras aplicaciones se usa para fabricar ricota. Calentamiento de la Cuajada. La masa o pasta cuajada, una vez haya sido cortada y desuerada, se procede a su calentamiento entre los 30/48ºC, mientras es agitada para que los granos permanezcan separados y no se vuelvan a unir. Cuanto más se calientan los cuadritos/granos de la masa, más seca resultará debido al mayor desprendimiento de suero. 114

En función de la temperatura a la que se ha sido sometida la masa o pasta, hablamos de pasta/masa blanda, pasta/masa semicocida, pasta/masa cocida. El Prensado del Queso. Finalizado el calentamiento, se procede al llenado de los moldes, que le darán la forma y el tamaño al queso. Los moldes pueden ser sometidos a una prensada. Esta presión produce una eliminación del suero y permite al queso, adoptar formas mucho más acentuadas. Así entonces hablamos de quesos de pasta/masa prensada y de quesos de masa/pasta no-prensada. Salación, el Salado del Queso. Una vez el queso se haya prensado, se pasa a la fase de salado, ésta puede ser hecha en seco, aplicándola directamente sobre la masa, o por inmersión en agua con sal o salmuera. Madurado. La Maduración del Queso La maduración es la última fase de la fabricación, ésta puede durar desde algunas horas, hasta varios meses, variando conforme con el tipo de queso que se quiere obtener. En este proceso de maduración se desarrollan una gran cantidad de aromas y sabores. La curación se lleva a cabo en zonas especialmente acondicionadas para ello, donde la temperatura y la humedad son las adecuadas para cada tipo de quesos, lo que implica adaptar o implementar instalaciones, con clima controlado, existiendo algunas regiones, incluso condiciones naturales de temperatura y humedad, dando un origen especial a sus quesos.

PRACTICA N° 14 PRODUCCIÓN DE INOCULANTES: MICROBIOLOGIA DEL SUELO MICROORGANISMOS FIJADORES DE NITROGENO Muchos microorganismos son capaces de aprovechar el nitrógeno molecular de la atmósfera. La conversión de ese nitrógeno a compuestos nitrogenados se llama fijación de nitrógeno. En este proceso están implicados dos grupos de microorganismos:

115

a)

b)

Bacterias no simbióticas: Que viven libre e independientemente en el suelo siendo los principales representantes los pertenecientes al género Azotobacter; microorganismos ovales aerobias y también el género Clostridium, microorganismos anaerobios. Aunque en estos últimos años se está investigando y descubriendo otros microorganismos que tienen capacidad de fijar el nitrógeno en forma asimbiótica. Bacterias simbióticas: Responsables de la fijación simbiótica del nitrógeno en las raíces de las plantas leguminosas, la fijación la realizan en íntima relación con las raíces de las leguminosas por eso se les llama fijadores simbióticos. La fijación simbiótica del nitrógeno se debe a la propiedad que tienen los Rhizobiums de vivir en cooperación mutua con las raíces de las plantas, como consecuencia de esta asociación el nitrógeno atmosférico molecular es tomado del aire por estas bacterias y combinado con otros elementos químicos para formar compuestos, las cuales son utilizados por las leguminosas para su desarrollo. En este caso las bacterias fijadoras de nitrógeno invaden las raíces de la planta huésped a través de los filamentos infectados, en algunas de las células de las plantas así infectadas, se produce ensanchamiento e incremento de la división celular que trae como consecuencia un crecimiento anormal (formación de nódulos) del sistema de raíces. Las leguminosas, las bacterias Rhizobias y los nódulos, constituyen el sistema para este tipo de fijación de nitrógeno. Es una secuencia ela que tanto los rhizobiums como la leguminosa se benefician mutuamente; pues los microorganismos producen Nitrógeno del que dispone la planta y, a su vez, los microorganismos obtienen alimento y abrigo en los tejidos de las plantas leguminosas. Esta actividad microbiana es de fundamental importancia en la fertilización natural de los terrenos de cultivo y en la colonización de terrenos eriazos, frente a los fertilizantes sintéticos que tiene una serie de inconvenientes y desventajas.

OBJETIVOS: 1. 2.

Reconocer y observar los nódulos en las raíces de las leguminosas y alfalfa. Extraer los microorganismos de los nódulos y realizar una observación microscópica mediante la coloración de Gram.

MATERIALES: -

Raíces de alfalfas u otra leguminosa Pinzas Tijeras Bisturíes Láminas portaobjetos Placas petri Batería de la coloración de Gram

PROCEDIMIENTO:

116

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

Sacar las raíces de las plantas con sumo cuidado (del lugar donde crecen (terrenos de cultivo). Lavar suavemente con agua de caño. Separar los nódulos de la raíz con tijera o bisturí cuidadosamente para no causar daño y colocarlos en la placa petri. Realizar observación de nódulos utilizando estereoscopio para observar los caracteres microscópicos Seleccione el nódulo más grande y vistoso Lavar una vez más con agua de caño Con el bisturí partir por la mitad el nódulo seleccionado Coger el portaobjetos y colocar una gotita de agua de caño Sobre esa gota de agua emulsione el contenido del nódulo partido Homogenizar la emulsión con el asa microbiológica Dejar evaporar al ambiente Realizar la fijación a la llama Realice la coloración de Gram Efectúe la observación microscópica con el objetivo de inmersión Anote y esquematice sus resultados

Analice y comente sus resultados Escoja un tema de investigación

117

MICROBIOLOGIA DEL SUELO II 1.

INTRODUCCION: Los Rhizobiums se pueden sembrar en medios de cultivo que contiene sustancias nutricionales apropiados para ellos.

2.

MATERIALES Y METODOS Materiales: -

Placa de Agar BYMA Asa microbiológica Nódulos de alfalfa Mechero Pinza Tijeras

Métodos: Lavar cuidadosamente los nódulos Fragmentar el nódulo con bisturí Con el asa, tomar el contenido del nódulo y sembrar en estría en la placa de Agar BYMA Poner a incubación a 37°C por 24 horas Segundo día -

Realizar el estudio de los caracteres culturales Realizar la coloración de Gram Realizar el estudio de los caracteres microscópicos

Comente y resalte la importancia del estudio del género Rhizobium para la agricultura.

118

119

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